衰老小鼠肝脏、脾脏和骨髓中Blm解旋酶表达水平*

郑艺， 杨爽， 黄晏军， 汤长宁， 刘杰麟**

(1.贵州医科大学 免疫学教研室, 贵州 贵阳 550025； 2.贵州医科大学 组织工程与干细胞中心, 贵州 贵阳 550004)

近年来，发现了多种衰老相关疾病基因，其中人类早老症相关基因研究进展最为突出。研究发现，解旋酶基因突变是早老症主要病因，RecQ解旋酶家族在核酸代谢过程中起了关键的作用，这一家族参与DNA复制、修复、重组、转录和维持端粒稳定[1]。Blm解旋酶是RecQ家族DNA解旋酶中的重要成员，在维持染色体的稳定性中具有重要作用，Blm解旋酶的缺失可导致Blm综合征(bloom’s syndrome，BS)[2]。Blm综合征是一种罕见的常染色体隐性遗传病，其临床特征为生长迟缓、学习障碍、免疫缺陷等，Blm综合征患者突出表现为特征性骨改变，包括骨质疏松症、手指关节变硬、锁骨的重吸收和纤维化、趾骨末端的重吸收等明显的早老特征，这类患者可伴发恶性肿瘤。Blm综合征患者常见免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)和免疫球蛋白 A(immunoglobulin A,IgA)低下或免疫功能缺陷。将Blm患者的淋巴细胞和成纤维细胞进行培养，可发现高比率的染色体畸变，染色体有变脆、易断裂倾向[3]。已有研究发现，Blm解旋酶的低表达可以上调P53蛋白的表达，而P53是肿瘤抑制基因之一[4]。Blm基因定位于染色体15q26.1，编码蛋白相对分子质量为159 kDa，是由1 417个氨基酸残基组成的蛋白质，在DNA重组中Blm可促进同源重组中间物质的溶解及阻止链的交叉，在DNA修复中Blm主要在细胞S期感知并应对DNA损伤[5]。本文通过制备衰老小鼠模型，检测衰老小鼠造血系统中Blm蛋白含量，并与正常发育小鼠比较，探讨Blm解旋酶在衰老小鼠中的变化。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器

C57BL/6小鼠由贵州医科大学实验动物中心外购后提供，合格证号SCXK-(军、PF级、8周龄、体质量18～22 g。D-半乳糖(D-gal)、苏木素-伊红(H-E)染色试剂盒、高效RIPA组织/细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、封闭血清等均购自北京索莱宝科技有限公司,总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒及丙二醛(MDA)测试盒购自南京建成生物工程研究所,兔抗人Bax多克隆抗体及兔抗人β-actin单克隆抗体购自美国Abcam公司,兔抗人Blm多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(二抗)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。酶标仪(美国Thermo公司)，5810-R型台式冷冻离心机(德国Eppendorf Germany公司)，电泳仪、垂直电泳槽、电转移槽(美国Bio-Rad公司)，曝光机(美国Bio-Rad公司)，电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂)，LEICA-RM2200切片机,LEICA-EG1150石蜡包埋机，显微镜(德国徕卡公司)。

1.2 方法

1.2.1分组及小鼠衰老模型构建 20只小鼠均分为正常对照组和衰老组，雌雄各半，衰老组小鼠构建衰老模型。将D-半乳糖粉末1 g溶于10 mL的无菌生理盐水中，使药物浓度达到100 g/L，经0.22 μm滤膜过滤除菌，4 ℃冰箱保存。造模时间共49 d，每天按 0.5 mg/g的剂量颈后部皮下注射D-半乳糖溶液；对照组按同样方法注射等量的生理盐水。

1.2.2小鼠一般情况、脾脏和胸腺组织形态观察 逐日观察两组小鼠的状态、进食量及饮水量,造模期间每6 d记录1次小鼠体质量，共记录10次小鼠体质量。连续注射7周后，颈椎脱臼处死小鼠，打开腹腔和胸腔暴露脾脏和胸腺，小心剥离出完整的脾脏和胸腺，利用苏木素-伊红(H-E)染色的方法做小鼠脾脏和胸腺组织切片。

1.2.3血清超氧化物气化酶及丙二醛水平检测 连续注射7周后，颈椎脱臼处死小鼠，摘眼球取血将小鼠血液收集到干燥清洁的EPP管中，做好标记，4 ℃静置2 h，低温离心(4 ℃，1 500 rpm/min，8 min)，吸取上层血清至新的EPP管中。利用黄嘌呤氧化酶法检测小鼠血清中SOD含量，采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定小鼠血清中MDA含量。

1.2.4Western blot检测小鼠肝脏、脾脏和骨髓Blm蛋白表达水平 连续注射7周后，分别取对照组和衰老组小鼠的肝脏、脾脏和骨髓，提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。取20 μg蛋白上样，8% SDS-PAGE 电泳，将蛋白转移至PVDF膜上、将PVDF膜浸入封闭液，室温封闭2 h，吸出封闭液后分别加入一抗BLM(1∶200)及β-actin 抗体(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜、洗膜(洗3次，每次10 min)，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5 000)，室温孵育2 h，洗膜，加入ECL发光液，曝光。用Graphpad Prism软件对曝光条带进行分析，目标蛋白半定量用该蛋白与β-actin的吸光度比值表示。

1.2.5免疫组织化学染色检测小鼠肝脏、脾脏和骨髓的Blm蛋白表达 造模完成后分别取对照组和衰老组小鼠的肝脏、脾脏和股骨，股骨经脱钙处理后与肝脏和脾脏一起脱水、透明、浸蜡、包埋、切片。石蜡切片常规脱蜡，DEPC抗原热修复(95 ℃，5 min)，室温下过氧化氢封闭10 min，消除内源性过氧化氢酶，加入山羊血清，37 ℃孵育30 min，滴加Blm抗体(1∶200)，4 ℃湿盒过夜。复温，PBS冲洗5 min×3次，滴加二抗，37 ℃下孵育30 min。PBS冲洗5 min×3次，将玻片浸入DAB溶液中显色，苏木精复染，脱水封片。在400倍显微镜下观察小鼠各组织切片的组织学改变。

1.3 统计学方法

各组实验均重复3次，所有数据采用SPSS 21.0软件进行统计处理。计量资料以均数(标准差(±s)表示，组间比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 衰老小鼠模型的鉴定

2.1.1一般情况 造模末期对照组小鼠皮肤弹性好，毛发细密不易脱落，反应灵敏、进食正常；衰老组小鼠皮肤松弛、毛发粗糙失去光泽且易脱落，精神萎靡，喜蜷缩，脊椎逐渐隆起，体形消瘦、进食少，见图1。对照组小鼠的初始平均体质量为(20.1±0.19)g，造模结束时的平均体质量为(30.1±0.24)g，小鼠平均体质量的增长为10.0 g；衰老组小鼠的初始平均体质量为(20.2±0.07)g，造模结束时的平均体质量为(28.6±0.11)g，小鼠平均体质量的增长为8.4 g。衰老组小鼠和外观形态特征、生存状态和体质量的改变，初步证明D-半乳糖衰老小鼠模型构建成功。

2.1.2血清SOD和MDA含量 衰老小鼠模型制备完成后，衰老组小鼠血清SOD含量[(105.3±4.8)U/mL]较对照组小鼠 [(174±5.4)U/mL]明显下降，差异有统计学意义(P<0.05);衰老组小鼠MDA含量[13.3±0.31(μmol/L)]较对照组小鼠[(4.72±0.42) μmol/L]明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.1.3肝组织中Bax蛋白表达 衰老组小鼠的肝脏切片中Bax蛋白的阳性表达(棕褐色颗粒)高于对照组小鼠，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

图1 两组小鼠肝组织Bax蛋白表达(SP，×400)Fig.1 Bax protein expression of mice in the two groups

2.1.4脾脏和胸腺组织学 对照组小鼠脾脏结构完整，白髓和红髓清晰，脾小梁没有增生，脾脏中淋巴细胞数目众多且形态正常，淋巴细胞核呈紫蓝色，色泽均一稳定；衰老组小鼠白髓和红髓不清，脾小梁明显增生，淋巴细胞数目明显减少，细胞形状不规则，细胞核发生固缩，表明淋巴细胞坏死增多。对照组小鼠胸腺包膜完整，皮质和髓质清晰；衰老组小鼠胸腺结构分散，胸腺细胞分布稀疏，皮质和髓质不清，说明D-半乳糖衰老小鼠模型构建成功。见图2。

2.2 Blm基因在小鼠肝脏、脾脏和骨髓中的表达

免疫组织化学染色和蛋白质印记两种方法都表明，衰老小鼠肝脏、脾脏和骨髓的Blm表达量低于对照组小鼠，差异有统计学意义(P<0.05)。图3、4。

3 讨论

近年来，世界人口老龄化程度日益加深，随着科学水平的不断发展，许多学者希望能够探索更多的衰老相关机制。建立适合的衰老动物模型是确保研究准确、高效进行的前提。研究证实，通过D-gal致衰老的造模方法所制备的衰老动物模型与自然衰老动物有较高相似性。D-半乳糖是一种小分子单糖，在体内的量正常时是一种生理营养成分，可被氧化为葡萄糖，为机体提供能量[6-7]，但是，当机体中D-半乳糖量过高时，氧化反应会使D-半乳糖被氧化成醛糖和过氧化氢，产生超氧阴离子和氧自由基，从而导致机体生理功能发生改变。表现出与衰老相似的症状[8]。相关研究表明机体细胞内半乳糖浓度升高，在酶的催化下还原成半乳糖醇，半乳糖醇不能被细胞代谢而堆积在细胞内，细胞渗透压发生改变，细胞出现功能障碍，加速衰老和凋亡[9]。

注：A为对照组小鼠脾脏，B为衰老组小鼠脾脏，C为对照组小鼠胸腺，D为衰老组小鼠胸腺图2 两组小鼠脾脏和胸腺组织学(SP，×400)Fig.2 Histology of spleen and thymus of mice in the two groups

注：A、B分别为衰老组和对照组小鼠肝脏Blm表达，C、D分别为衰老组和对照组小鼠脾脏Blm表达，E、F分别为衰老组和对照组小鼠骨髓Blm表达图3 免疫组织化学染色检测小鼠肝脏、脾脏和骨髓中组织Blm的表达(SP，×400)Fig.3 The expressions of Blm protein in the liver, spleen and bone marrow of mice detected by immunohistochemistry

人类RecQ解旋酶基因家族包括RecQL1、RecQL5、Blm、Wrn及RecQL4 5个成员，后三者的突变均导致了相关的疾病，依次为Bloom综合征、Werner 综合征和RTS综合征[10-11]。Sharma等[12]发现，Blm解旋酶具有促进细胞DNA复制、修复、重组以及维持基因组稳定性的功能。对秀丽隐杆线虫的研究发现，基因确实可以影响生物的衰老及寿命，衰老的发生机制并非由单一基因决定，可能是一个基因群[13]。细胞衰老是生物衰老的基本单位，是老年病发病的共同基础，细胞衰老与机体衰老直接相关。中老年癌症发病率较高，癌症是一种与衰老有关的疾病，衰老生物学与癌症生物学存在着许多相似之处，癌症与衰老的分子学机制又有着相互重叠的方面。因此，有关衰老的细胞及分子生物学机制的研究对于癌症的发生机制和抗肿瘤研究均具有重要价值。Blm解旋酶在与衰老有关的DNA损伤修复、端粒维护及线粒体功能障碍等方面发挥了重要作用[14-15]。因此，Blm可能在癌症和衰老中发挥桥梁作用。孟惠惠等[16]发现，3 株肿瘤细胞株中均高度表达Blm mRNA及蛋白。Wang 等[15]发现，在肿瘤中Blm表达高于正常组织。Yan 等[11]研究表明，食管鳞癌细胞中BLM 表达上调2.927 倍，提示Blm的高表达与肿瘤的发生密切相关。

注：A为小鼠肝脏，B为小鼠脾脏，C为小鼠骨髓；(1)与对照组比较，P<0.05图4 各组小鼠肝脏、脾脏和骨髓组织中Blm表达(Western Bolt)Fig.4 The expressions of Blm protein in the liver, spleen and bone marrow of mice detected by Western Bolt

SOD是体内的抗氧化酶，可清除体内氧自由基，SOD活力下降，不能消除过多的活性氧自由基(ROS)，ROS堆积过多后引起细胞损伤甚至凋亡，小鼠体内SOD的含量可反应小鼠的衰老程度。衰老小鼠血清中脂质过氧化物丙二醛MDA的含量明显增高，MDA能够间接反映机体内脂质过氧化的程度和细胞损伤的程度。本研究通过连续注射D-半乳糖，制造衰老小鼠模型，并通过检测衰老模型组小鼠的生存状态、体重变化、血清中SOD、MDA含量、Bax蛋白表达量、脾脏和胸腺组织形态学切片的观察和检测，与对照组小鼠比较，确定小鼠衰老模型构建成功。获得衰老小鼠模型后，采用石蜡切片免疫组织化学染色和蛋白印迹两种方法分别对模型组小鼠和对照组小鼠的肝脏、脾脏和骨髓做了Blm表达的定位、定性、半定量对比分析，最终得出结论，衰老小鼠体内Blm的表达低于正常对照组小鼠。综上所述，Blm解旋酶含量的改变可能与衰老发生的机制相关。