PKA抑制剂在雌激素调控乳腺癌细胞纤连蛋白表达中的作用及机制*

王宏健， 刘晓红， 董宇华， 郭阳， 王旭东

(贵州医科大学 基础医学院 生理学教研室， 贵州 贵阳 550025)

calpain 2乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，其中约70%为雌激素(Estrogen, E2)依赖性[1]。E2不仅在女性生殖系统和乳腺生长发育等生理功能调节中发挥重要作用，在异常情况下，E2也是促进乳腺癌恶性进展的重要因素[2-4]。E2可以使乳腺癌细胞内环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)增多，从而激活蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)，激活的cAMP/ PKA途径可抑制乳腺癌细胞的迁移[5-8]。有研究显示，纤连蛋白(fibronectin, FN)的表达促进乳腺癌细胞的恶性行为[9]，其机制尚未完全阐明。钙激活中性蛋白酶(calcium-activated neutral protease，CANP)属于Ca2+依赖性的半胱氨酸蛋白酶水解家族，据报道其活性在乳腺癌异常增高[10]。然而，关于PKA是否通过CANP参与调控E2信号分子机制，目前尚未完全阐明。本研究以MCF-7细胞和CANP2-shRNA转染细胞为模型细胞，采用伤口愈合实验和蛋白免疫印迹实验等方法，观察PKA抑制剂对E2诱导乳腺癌细胞的迁移和FN蛋白表达的影响，同时观察其与CANP的关系，为研究E2促进乳腺癌恶性进展的机制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1细胞系及试剂 人乳腺癌细胞系MCF-7购自中国科学院昆明细胞库，DMEM培养基、胰蛋白酶及青霉素/链霉素均购自美国HyClone公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS) 购自Gibco公司。

1.1.2抗体及重要试剂17β-雌二醇(17β-estradiol，E2) 购于Sigma公司、H89(PKA抑制剂)购自碧云天生物技术公司，抗FN、calpain2单克隆抗体，抗GAPDH抗体由Santa cruz公司购买，羊抗小鼠IgG-HRP抗体购自武汉博士德公司，CANP2-shRNA设计、合成和构建由上海吉玛制药有限公司提供。

1.2 人乳腺癌MCF-7细胞

1.2.1细胞培养 人乳腺癌细胞MCF-7采用DMEM高糖培养基(含10% FBS、1%青霉素及1%链霉素)，在37 ℃及5%CO2条件下常规培养，待细胞满度达90%时进行传代培养。

1.2.2细胞划痕实验 取对数生长期MCF-7细胞混悬液按每孔1 mL接种于12孔培养板中，细胞覆盖率达90%后，换成无血清DMEM，用10 μL枪头作“|”字划痕，用无菌PBS洗涤3次，换无血清的DMEM，随机分为4组，分别加入0.1% DMSO(对照组)、10 nmol/L(E2组)、10 mg/L(H89组)、10 nmol/L E2+10 mg/L H89(E2+H89联合组)处理，置于培养箱内培养。分别于0 、12及24 h时用倒置显微镜下拍照。每孔随机取3个位点，用Photoshop软件标尺测量划痕宽度，测算细胞划痕部位“伤口”宽度，实验重复3次。计算细胞迁移率=[(0 h伤口宽度-12或24 h伤口宽度)/0 h伤口宽度]×100%。

1.2.3Western blot检测FN蛋白表达 培养MCF-7细胞满度达50%～60%后，将培养基换为无血清DMEM，同时将细胞分为对照组(0.1%DMSO)、E2组(10 nmol/L E2)、H89组(10 mg/L)及E2+ H89组(10 nmol/L E2+10mg/L H89)。药物作用48 h后，加入RIPA裂解液裂解细胞。4 ℃，12 000 r/min离心20 min后取样品上清液留用，采用BCA法进行蛋白定量。每个泳道按30 μg蛋白质样品进行上样，按照Western blot实验，采用自动凝胶成像系统(Syngene公司)成像，GeneSnap软件分析蛋白印迹结果。

1.3 CANP2-shRNA转染人乳腺癌MCF-7细胞

1.3.1CANP2-shRNA转染MCF-7细胞与稳定表达细胞株的筛选 按照说明书要求进行CANP2-shRNA转染并且筛选出稳定表达的细胞株，待细胞达到检测所需满度时，使用荧光显微镜观察并且通过Western blot检测转染效率，获得稳定表达的细胞株后继续在CO2培养箱中37 ℃温育24～48 h后，用嘌呤霉素处理筛选出稳定表达的细胞株。同时转染与CANP2无同源性的序列作为阴性对照组(NC组)。

1.3.2细胞划痕实验 取对数生长期CANP2-shRNA稳定表达细胞株的MCF-7细胞株和NC(negative control)细胞按每孔1 mL接种于12孔培养板中，细胞覆盖率达90%后，换成无血清DMEM，用10 μL枪头作“|”字划痕，用无菌PBS洗涤3次，换无血清的DMEM，均随机分为4组，分别为对照组、E2组、H89组及E2与H89联合组，其余处理同1.2.2。

1.3.3Western blot检测FN蛋白表达 培养的CANP2-shRNA稳定表达细胞株MCF-7细胞和NC细胞覆盖率达50%～60%后，将培养基换为无血清DMEM，同时将细胞分为对照组(0.1% DMSO)、E2组(10 nmol/L E2)、H89组(10 mg/L)及E2+ H89组(10 nmol/L E2+10 mg/L H89)，其余处理同1.2.3。

1.4 统计学处理

采用软件prism 6.2处理和分析数据，实验结果以均数±标准差表示。组间比较采用单因素方法one-way ANOVA进行分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H89对人乳腺癌MCF-7细胞的作用

2.1.1H89增强E2诱导的人乳腺癌MCF-7细胞迁移效应 与对照组比较，E2可明显增加MCF-7细胞的12 h和24 h时的迁移率,分别增加(14.30±0.62)%和(28.74±3.89)%，差异有统计学意义(P<0.05)。H89组MCF-7细胞24 h时，可促进MCF-7细胞的迁移，与对照组比较，迁移率增加了(20.41±1.46)%，差异有统计学意义(P<0.05)。H89与E2组MCF-7细胞作用24 h后，细胞的迁移率增加了(31.71±2.13)% 。与E2组比较，H89与E2联合作用后，MCF-7细胞的12 h和24 h的迁移率均明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.1.2H89增加E2诱导的MCF-7细胞FN蛋白表达 与对照组比较，E2组FN蛋白表达增加(121.9±9.342)%；H89 FN蛋白的表达增加(115.4±8.89)%，差异有统计学意义(P<0.01)；与E2组比较，H89+E2组MCF-7细胞FN蛋白表达增加(105.9±15.9)%，差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

(1)与对照组比较, P<0.05 ；(2)与E2组比较, P<0.05图1 H89对E2诱导的MCF-7细胞迁移的影响Fig.1 Effect of H89 on E2-induced migration of MCF-7 cells

(1)与对照组比较, P<0.01;(2)与E2组比较,P<0.01图2 H89对MCF-7细胞纤连蛋白表达的影响Fig.2 Effect of H89 treatment on the expression of FN in MCF-7

2.2 H89对CANP2-shRNA转染MCF-7细胞的作用

2.2.1CANP2-shRNA转染后MCF-7细胞中CANP2蛋白表达 与NC组比较，CANP2-shRNA转染MCF-7乳腺癌细胞组CANP2蛋白表达量降低了(88.47±7.07)%，差异有统计学意义(P<0.01)，见图3。结果提示沉默CANP2基因后，筛选的稳定表达细胞株满足实验要求。

(1)与对照组比较 , P<0.01图3 CANP2-shRNA转染MCF-7细胞CANP2蛋白的表达Fig.3 Expression of CANP2 protein in CANP2-shRNA transfected cells

2.2.2CANP2-shRNA转染MCF-7细胞中，H89的促细胞迁移效应 H89组明显降低CANP2-shRNA转染MCF-7细胞的迁移率，见图4A；与NC组比较，H89组CANP2-shRNA转染MCF-7细胞迁移率24 h和48 h时分别降低了(66.67±9.67)%和(123.04±20.54)%，差异有统计学意义(P<0.01)，见图4B。基因沉默CANP2后，与NC组比较，E2+H89联合组CANP2-shRNA转染MCF-7细胞的迁移率显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见图4C。E2+H89组细胞迁移率24和48 h的细胞迁移率分别降低(78.12±6.12)%和(115.35±12.09)%，见图4D。

(1)与对照组比较 , P<0.01图4 基因沉默CANP2逆转H89的促细胞迁移的影响Fig.4 Transfection of shRNA CANP2 reversing the effect of H89 on cell migration

2.2.3H89抑制CANP2-shRNA转染MCF-7细胞中FN蛋白表达 H89单独作用于CANP2-shRNA转染MCF-7细胞，与NC组比较，FN蛋白的表达明显减少，相对蛋白表达量减少(60.52±4.99)% ，差异有统计学意义(P<0.01)；H89与E2联合使用时，与NC组比较，CANP2-shRNA转染MCF-7细胞的FN蛋白表达减少(81.75±4.26)%，差异有统计学意义(P<0.01)。见图5。

(1)与对照组比较, P<0.01图5 H89对CANP2-shRNA转染MCF-7细胞FN蛋白表达的影响Fig.5 Effect of H89 on the expression of fibronectin in cell line of CANP2 gene silencing

3 讨论

近年来，乳腺癌的早期诊断和临床治疗取得了较大进展，但绝大多数病人仍死于肿瘤的转移。大量研究表明，作为体内主要的性激素，E2能刺激乳腺肿瘤的生长并促进其转移和侵袭[11]，但其具体作用机制尚未完全阐明。cAMP/PKA 通路是一条经典的由 G 蛋白偶联受体介导的细胞信号传导通路，参与细胞的增殖、分化及凋亡、离子转运、调节新陈代谢及基因转录相关[12-13]。Filardo等人[14]的研究显示，在MCF-7和SKBR3细胞中，E2可以快速激活膜结合的腺苷酸环化酶 (adenylate cyclase, AC)，进而在数分钟内即引起细胞内cAMP浓度增高，并激活PKA，继而引起细胞功能的改变。因此，阐明E2-PKA下游信号通路，有助于加深对E2促癌效应分子机制的认识。Clarysse等[15]报道，激活cAMP-PKA 途径能降低人乳腺癌MDA-MB-435s的细胞迁移率。Lee等[16]的研究表明，cAMP-PKA也能调控宫颈癌细胞的迁移。在本研究中结果亦显示单独使用H89能够增加细胞的迁移率。本研究发现，PKA选择性抑制剂H89可明显增强E2的促细胞迁移效应，提示cAMP/PKA途径对E2促细胞迁移效应可能具有负性调控作用。国内外均有研究显示，肿瘤中FN表达增加和表型改变可促进肿瘤的增殖，迁移和侵袭；而且还可以限制肿瘤细胞对治疗的反应性[17-18]。同时本课题组的前期研究显示E2可通过上调FN来促进MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌细胞的迁移[19]。而本研究结果显示H89能够显著增强E2对MCF-7细胞纤连蛋白FN表达的上调作用，表明cAMP/PKA途径对E2的抑制效应可能也与纤连蛋白FN表达有关。有研究显示，cAMP/PKA可通过CANP而调控细胞迁移活动[20]。本课题组亦曾报道，CANP抑制剂Calpeptin(Calp)能明显抑制E2诱导的FN蛋白上调[19],但Calp对CANP1和CANP2均有抑制效应，不能明确何种CANP亚型参与对FN的上调作用。

为进一步查明E2-PKA下游是否通过CANP2分子来影响乳腺癌细胞的迁移及FN表达，本研究采用CANP2-shRNA转染模型细胞并筛选稳定表达细胞株。结果发现，基因沉默CANP2后，H89对E2促细胞迁移效应的上调作用受到明显抑制。同时，基因沉默CANP2后，H89对E2诱导的FN蛋白表达上调的作用也被逆转。这些结果提示，PKA通过CANP2-FN通路对E2促癌效应发挥重要的负性调控作用。表明E2诱导乳腺癌细胞FN蛋白表达和细胞迁移与PKA-CANP2通路有关。