宫颈癌组织中TESTIN和DMBT1蛋白表达水平与其病理特征的关系

李志强， 魏艳玲， 高静

(河北北方学院附属第二医院 病理科， 河北 张家口 075100)

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤，其发病率在全球范围内高居女性恶性肿瘤第三位， 近年来发病率呈逐年升高趋势[1]。肿瘤的分化和转移是导致肿瘤死亡率升高的重要原因，研究发现， 80.0%以上宫颈癌死亡病例是肿瘤转移和侵袭所致[2]，因此明确宫颈癌的转移和侵袭病理生理机制，对于早期明确诊断和提高治疗及预后质量至关重要。近年来，随着宫颈癌分子生物学研究的不断深入，多项生物学指标在宫颈癌的诊断、预后评估及靶向治疗等方面受到高度关注[3]。研究发现，TESTIN和脑恶性肿瘤缺失基因1(DMBT1)在非小细胞肺癌、结肠癌及肝癌等多种癌组织中表达水平较正常组织明显下降[4-6]，提示TESTIN和DMBT1可能与肿瘤细胞的发生发展有关，但关于TESTIN及DMBT1与宫颈癌发生发展的研究较少，本研究通过分析不同病理特征的宫颈癌组织中TESTIN及DMBT1表达情况，探讨TESTIN及DMBT1蛋白表达与宫颈癌病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 一般临床资料及试剂

1.1.1一般临床资料 选取2016年1月～2018年4月收治的47例宫颈癌患者作为宫颈癌组(包括宫颈癌Ⅰ期26例、宫颈癌Ⅱ期21例)，同期宫颈内瘤样病变(CIN)患者40例作为CIN组(包括CINⅠ级21例、CINⅡ～Ⅲ级19例)，同期行子宫全切术的子宫肌瘤患者40例(术后病理排除宫颈病变)作为对照组。纳入标准：(1)均符合《2016年NCCN宫颈癌临床实践指南》[7]中宫颈癌或CIN临床诊断标准、且经两位资历丰富的病理医师确诊，(2)均行广泛性全子宫切除术联合盆腔淋巴结清扫术治疗，(3)均经2013年版国际妇产科联盟(FIGO)[8]分期标准证实为Ia～IIb期，(4)手术前均未接受放化疗或其他疗法治疗，(5)研究对象或家属知情同意。排除标准：(1)合并子宫内膜癌等其他类型恶性肿瘤患者，(2)合并严重的心脑血管、肝肾肺等实质性脏器组织疾病患者，(3)合并严重的全身性疾病患者。宫颈癌组患者26～69岁、平均 (46.25±8.59)岁，CIN组23～66岁、平均 (45.90±8.37)岁，对照组22～70岁、平均(46.58±8.81)岁。3组研究对象的一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具可比性。该研究获得医院伦理委员会批准。

1.1.2主要试剂 鼠抗人单克隆TESTIN抗体及DMBT1抗体购自黄石研科生物科技有限公司，免疫组织化学SP法试剂盒及PBS缓冲液购自深圳欣博盛生物科技有限公司。

1.2 方法

于手术时收集3组研究对象的宫颈组织，采用免疫组织化学SP法检测TESTIN及DMBT1表达，将宫颈组织经固定、脱水、透明、包埋、切片等步骤完成切片，再将切片于60 ℃烘箱中烘烤30 min，经过二甲苯和酒精梯度脱蜡、脱水，利用枸橼酸缓冲液进行抗原修复，依次加入内源性过氧化物酶和封闭液进行封闭20 min、甩干，加入一抗工作液(TESTIN及DMBT1抗体均按1∶100稀释)孵育过夜，次日加入二抗孵育20 min，依次滴加ABC液和DAB显色剂，最后加入苏木精进行复染，二甲苯和酒精梯度脱蜡、脱水后封片，镜下观察染色情况。结果判定[7-8]：高倍显微镜下随机选取5个视野(×200)，每个视野读取细胞计数≥100个，每例涂片由两名病理医师共同计数并取平均值，对细胞染色强度和阳性表达率分别按设计标准进行打分，再将二者分值相乘记为最终得分，细胞染色强度评分为棕褐色记3分、棕黄色记2分、淡黄色记1分及未着色记0分，细胞阳性表达率评分为阳性表达率>75%记4分、51%≤～≤75%记3分、26%≤～≤50%记3分及1%≤～≤25%记3分，<1%记0分。

1.3 观察指标

(1)比较3组宫颈组织中TESTIN级DMBT1蛋白阳性表达率，(2)分析不同分化程度、是否淋巴结转移及不同病理类型宫颈癌组织中的TESTIN及DMBT1表达水平，(3)采用Spearman法分析TESTIN及DMBT1表达与宫颈癌临床病理特征的相关性。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 TESTIN及DMBT1蛋白

由图1和图2可见，TESTIN及DMBT1在细胞胞浆和胞核中均有表达，在癌组织和癌前组织(CIN)中表达量少、在正常宫颈组织中表达较高，随着宫颈癌的恶性程度的升高，TESTIN及DMBT1阳性表达量均呈逐渐下降趋势。表1结果显示，宫颈癌组织中TESTIN及DMBT1蛋白阳性表达率显著低于CIN组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

注：A为对照，B为CIN Ⅰ级，C为CIN Ⅱ～Ⅲ级，D为宫颈癌Ⅰ期，E为宫颈癌Ⅱ期图1 各组宫颈组织中TESTIN蛋白表达(SP,×200)Fig.1 Expression levels of TESTIN protein in normal tissues and cervical tissues

注：A为对照，B为CIN Ⅰ级，C为CIN Ⅱ～Ⅲ级，D为宫颈癌Ⅰ期，E为宫颈癌Ⅱ期图2 各组宫颈组织中DMBT1蛋白表达(SP,×200)Fig.2 Expression levels of DMBT1 protein in normal tissues and cervical tissues

表1 各组宫颈组织中TESTIN及DMBT1蛋白阳性表达率(n,%)Tab.1 The percentages of TESTIN and DMBT1 positive proteins in three groups of cervical tissues

(1)与宫颈癌组比较，P<0.05

2.2 宫颈癌组织中的TESTIN及DMBT1蛋白表达水平

表2结果显示，低分化宫颈癌患者宫颈癌组织中TESTIN和DMBT1蛋白表达水平显著低于中分化和高分化患者(P<0.05)，有淋巴结转移宫颈癌患者显著低于无淋巴转移患者(P<0.05)，鳞癌型宫颈癌患者虽较腺癌型患者有所降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 TESTIN和DMBT1表达与宫颈癌临床病理特征相关性

Spearman分析显示，TESTIN在组织中的表达量与淋巴结转移(r=-0.155，P=0.044)、脉管瘤栓(r=-0.183，P=0.010)呈负相关，与分化程度(r=0.172，P=0.016)呈正相关；DMBT1在组织中的表达量与淋巴结转移(r=-136，P=0.027)呈负相关，与分化程度(r=0.214，P=0.009)呈正相关。

表2 不同病理特征宫颈癌组织中TESTIN和DMBT1表达Tab.2 TESTIN and DMBT1 expression levels in cervical cancer tissues with different pathological features

3 讨论

目前，基于宫颈癌病因学、临床病理资料与疗效及预后相关性报道较多，但越来越多研究显示，分子生物学指标在宫颈癌发生发展中起着重要作用，其不仅可预测患者病情程度和临床预后结局，并有望为宫颈癌的靶向治疗提供标准参考[9]。癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活是宫颈癌发生发展的分子生物学基础[10]。DMBT1基因由缺失纯合子的成纤维管细胞瘤细胞系中克隆而来，是SRCR超家族的一份子[11]。研究发现，DMBT1基因与人体的免疫防御、黏膜保护以及上皮细胞分化有着密切联系[12]。同时，大量研究也表明，DMBT1基因在多种肿瘤组织(如乳腺癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌及肾癌等)中呈异常低表达，推测其可能与肿瘤的发生、发展密切相关，是候选的抑癌基因[13-15]。TESTIN基因广泛表达于人体正常组织，但在多种肿瘤组织中表达缺少，提示其可能也是一个候选抑癌基因[16]。目前，DMBT1和TESTIN基因在宫颈癌的表达情况在国内外报道较少，本研究通过对检测分析DMBT1和TESTIN在宫颈癌组织的表达情况，进一步探究其抑癌作用。

本研究结果显示，TESTIN和DMBT1在胞浆和胞核中均有表达，在癌组织和癌前组织中表达量少，正常宫颈组织中表达较高，随着恶性程度的升高，阳性表达量均呈逐渐下降趋势。宫颈癌组织中TESTIN和DMBT1蛋白阳性表达率明显低于CIN组和对照组(P<0.05)。同时，在不同分化程度的宫颈癌组织中对比也发现，低分化宫颈癌患者癌组织中TESTIN和DMBT1表达明显低于中、高分化宫颈癌患者(P<0.05)；对是否具有淋巴转移情况分析发现，TESTIN和DMBT1表达有转移患者明显低于无转移患者(P<0.05)；而对不同病理类型宫颈癌组织对比发现，腺癌与鳞癌2组TESTIN和DMBT1表达差异无统计学意义(P>0.05)。另外单因素分析显示，宫颈癌组织TESTIN和DMBT1阴性表达与淋巴结转移和低分化明显相关。以上结果提示，TESTIN和DMBT1基因在宫颈癌中可能起到抑癌作用，与宫颈癌恶性程度呈负相关，这与其他肿瘤研究结果一致[17-18]。

综上所述，宫颈癌组织中TESTIN和DMBT1存在明显缺失，TESTIN和DMBT1蛋白低表达，且与宫颈癌分期、转移及侵袭密切相关，可作为宫颈癌恶性进程及预后评估的重要分子生物学指标。