丹黄散对糖尿病大鼠溃疡创面愈合的影响机制*

邸铁涛， 张春玲**， 陈露， 侯丹， 刘洹颖， 龙丽， 黄蔷

(1.贵州中医药大学第二附属医院， 贵州 贵阳 550001; 2.贵州中医药大学， 贵州 贵阳 550025)

糖尿病溃疡(diabetic ulcers，DU)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最常见的并发症之一，据统计30% 的糖尿病患者会发生皮肤溃疡，且溃疡存在难以愈合等问题。目前促进糖尿病溃疡愈合成为研究热点，调控生长因子的辅助疗法在糖尿病溃疡治疗中具有显著优势[1]。研究发现，溃疡的愈合与创面的表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等密切相关，这些因子的表达可促进创面的愈合[2]。中药丹黄散由大黄、丹参、当归、沉香、松香、没药共六味传统中药组成，具有清热解毒、祛腐生肌等功效[3-5]。研究显示，丹黄散可明显促进糖尿病患者溃疡创面的愈合，具体有很好的临床疗效[6]，但其促愈机制尚未见报道。本实验通过建立SD大鼠糖尿病溃疡模型，使用中药丹黄散外敷糖尿病大鼠溃疡创面，观察创面愈合过程中大鼠血清及局部创面组织中EGF、bFGF、VEGF的表达水平，探讨丹黄散促进糖尿病溃疡愈合的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物、试剂与仪器 SPF级SD大鼠，雄性，200 g左右，购自重庆医科大学动物研究所。酶联免疫试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，VFGF、β-actin购自proteintech公司，bFGF、EGF购自美国abcam公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/山羊抗小鼠IgG购自中山金桥公司。

1.1.2药物制备 中药丹黄散由贵州中医药大学第二附属医院药剂科制备，大黄、丹参、当归、沉香、松香、没药六味中药按照1∶1比例混合、粉碎、过六号筛后取细粉。对照西药选用重组人EGF凝胶(购自桂林华诺威基因药业有限责任公司，批号14020213)。

1.2 实验方法

1.2.1模型制备12只对照组大鼠正常饲料喂养。36只大鼠制作糖尿病大鼠模型。糖尿病大鼠模型制备采用目前较为常用糖尿病溃疡制作方法[7]。SD大鼠采用高脂高糖饲料喂养一个月，隔夜禁食后腹腔注射STZ 40 mg/kg，3 d后测空腹血糖大于16.7 mmol/L为造模成功。糖尿病大鼠造模成功后第5天，在所有大鼠(含正常对照组)背部较为平坦之处脱毛，龙胆紫标记约1.5 cm×1.5 cm面积，将该区域皮肤剪去，深达筋膜。

1.2.2分组与给药 将实验大鼠随机分为正常对照组(NC)、糖尿病溃疡组(DM)、糖尿病溃疡-丹黄散组(DM-中药)、糖尿病溃疡-EGF组(DM-西药),每组各12只大鼠；后3组大鼠制备糖尿病溃疡模型，造模成功24 h后，DM组大鼠创面仅用碘伏消毒，DM-中药组大鼠创面碘伏消毒后外敷“丹黄散”,DM-西药组大鼠创面碘伏消毒后外敷重组人EGF凝胶；NC组大鼠溃疡表面用碘伏消毒；各组大鼠背部溃疡均用6层医用小纱布(6 cm×6 cm)覆盖，用医用胶布包扎固定，每天换药1次，观察至溃疡创面完全愈合，隔日创面拍照并记录最终愈合时间。丹黄散用量参照临床成人用量，根据徐叔云[8]的计算公式，大鼠等效剂量相当于人的9.1倍，得出大鼠丹黄散膏剂用量为2 g；重组人EGF凝胶用量也为2 g；敷药面积均为超出创面边缘0.2 cm，厚度为0.2 cm。

1.2.3溃疡愈合率 造模后第1天、14天、28天测定大鼠溃疡创面面积，采用快示格胶贴勾画溃疡场面轮廓线，置于白色背景 A4纸上，拍照，采用ImageJ计算其面积。创面愈合率(%)=(初始面积-当前测量面积)/初始面积×100%[9]。

1.2.4血清bFGF、EGF及VFGF水平检测 干预后第14、28天，大鼠内眦取血，分离血清，按照bFGF、EGF及VFGF的酶联免疫试剂盒说明书操作并制作标准曲线，每孔加待测样本10 μL、样品稀释液40 μL，加酶50 μL，37 ℃孵育30 min，洗涤5次，显色，终止，检测OD450值,计算大鼠血清中bFGF、EGF及VFGF的含量，记录实验数据。

1.2.5Q-PCR检测大鼠新生肉芽组织中bFGF、EGF及VFGFmRNA的表达 干预后第14、28天取各组大鼠新生肉芽组织，提取RNA，采用Q-PCR法检测大鼠新生肉芽组织中bFGF、EGF及VFGFmRNA的表达量。引物序列：EGF上游引物为5′-AAGATCGTAGAGCCAGGC，下游引为CCTCGATGCTCTGGT TTA-3′；bFGF上游引物为5′-TCCAGGCGTTCAAAGAAGAA-3′，下游引物为5′-CCATCAAGGGAGTGTGTGC-3′；VEGF上游引物为5′-GGCA GCTTGTAAACGAAC-3′，下游引物为5′-TGGTGACATGGTTAATCGGTC-3′。反应体系为：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL、PCR Forward Primer 0.8 μL、PCR Reverse Primer 0.8 μL、ROX Reference Dye 0.4 μL、dH2O 6 μL、DNA 模板2 μL,进行相对定量，实验结果重复3次以上。

1.2.6Western Blot 检测大鼠新生肉芽组织中bFGF、EGF及VFGF蛋白表达 干预后第14、28天取各组大鼠少量新生肉芽组织，提取蛋白定量后保存。配置10%的SDS-PAGE蛋白凝胶进行电泳，转膜，封闭，随后分别用bFGF、EGF、VFGF及β-actin的一抗室温孵育2～3 h，用相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶4 000)室温孵育1 h，超敏发光液显色，Western Blot曝光仪中曝光。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 创面愈合情况

干预后第14、28天，与DM组比较，NC组、DM-中药组及DM-西药组大鼠背部创面愈合率均明显提高，差异具有统计学意义(P<0.05)；干预后第28天，DM-中药组创面愈合率高于DM-西药组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：A为大鼠背部创面，B为干预第14天，C为干预第28天，(1)与DM组比较，P<0.05；(2)与DM-西药组比较，P<0.05图1 各组大鼠不同时间点背部溃疡创面愈合情况及愈合率Fig.1 The effect of Danhuang powder on wound healing and healing rate of rat back ulcers at different time points

2.2 血清中bFGF、EGF、VEGF含量

干预后第14、28天，与DM组比较，NC组、DM-中药组、DM-西药组大鼠血清中bFGF、EGF及VEGF含量明显提高(P<0.05)；干预后第28天，DM-中药组大鼠血清中bFGF、EGF及VEGF含量高于DM-西药组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清中bFGF、EGF、VEGF水平Tab.1 The effect of Danhuang powder on the levels of serum bFGF, EGF and VEGF

(1)与DM组比较，P<0.05；(2)与DM-西药组比较，P<0.05

2.3 背部溃疡创面新生肉芽组织中bFGF、EGF、VEGF mRNA表达

干预后第14、28天，与DM组比较，NC组、DM-中药组、DM-西药组大鼠新生肉芽组织中bFGF、EGF及VEGFmRNA表达水平明显提高(P<0.05)；干预后第28天，DM-中药组大鼠新生肉芽组织中bFGF、EGF及VEGFmRNA表达水平高于DM-西药组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2。

(1)与DM组比较，P<0.05；(2)与DM-西药组比较，P<0.05图2 各组大鼠新生肉芽组织中bFGF、EGF、VEGF mRNA表达水平Fig.2 The effect of Danhuang powder on the mRNA expression levels of bFGF, EGF and VEGF in newborn granulation tissues

2.4 背部溃疡新生肉芽组织中bFGF、EGF及VFGF蛋白表达

干预后第14、28天，与DM组比较，NC组、DM-中药组、DM-西药组大鼠背部溃疡新生肉芽组织中bFGF、EGF、VEGF 蛋白表达水平明显提高，差异具有统计学意义(P<0.05)；干预后第28天，DM-中药组大鼠新生肉芽组织中bFGF、EGF、VEGF 蛋白表达水平高于DM-西药组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图3。

3 讨论

糖尿病溃疡是糖尿病常见并发证之一，具有迁延不愈、反复发作等特点，给患者带来极大的心理压力和经济负担，是临床急需解决的重要问题之一[10]。糖尿病溃疡创面愈合的过程是多因子共同参与的。分子辅助治疗糖尿病溃疡过程中，bFGF、EGF和VFGF三者均扮演着重要的作用[11]。bFGF可直接作用于其靶细胞，通过促有丝分裂反应，使成纤维细胞分裂、增殖，起到促进创面愈合的作用。EGF是一种广泛存在于人和动物体内的细胞因子，EGF受体存在于多种细胞膜上,受体与EGF结合后形成受体-EGF复合物,通过自磷酸化等一系列生化反应诱导或直接调控细胞增殖，从而启动创面修复的过程[12]。VEGF是一种特异性作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子,它不仅能引起血管通透性增加、细胞外基质成分改变，还能诱导新生血管形成[13-14]。

中药的有效成分外用外治法是中医治疗糖尿病足的特色疗法,在糖尿病溃疡的研究中存在重要的临床意义[15]。 丹黄散主要功效有活血化瘀、拔脓祛腐、托疮生肌、利湿解毒等。方中丹参、大黄共为君药，丹参不仅除了具有活血痛经、清心除烦、保护心脑血管等作用，还具备促进糖尿病溃疡坏疽愈合、保肝、抗肿瘤、抗心肌缺血等作用[16]; 大黄的有效成分不仅具有抗肿瘤、辅助治疗糖尿病肾病的作用，还可以保护脓毒症胃肠功能衰竭患者，与此同时其提取物对脂多糖诱导的内皮细胞损伤也具有一定的保护作用[17]；当归为臣药，能够补气活血，在抗肿瘤、糖尿病治疗、血管性痴呆中发挥作用[18]；没药、沉香为佐药，具有止痛、活血、抗菌消炎作用[19]；松香与丹参具有相似的促进糖尿病溃疡创面愈合的作用为使药[20]。

(1)与DM组比较，P<0.05；(2)与DM-西药组比较，P<0.05图3 各组大鼠背部溃疡新生肉芽组织中bFGF、EGF、VFGF蛋白表达Fig.3 The effect of Danhuang powder on the protein expression levels of bFGF, EGF and VEGF in newborn granulation tissues

本研究应用将中药丹黄散外敷于糖尿病大鼠溃疡创面，利用中药外治溃疡，从实验结果来看，糖尿病溃疡组大鼠血清中bFGF、EGF、VEGF较正常大鼠显著降低，使用丹黄散外敷后，在大鼠血清及新生肉芽组织中bFGF、EGF、VFGF因子表达水平升高，表明丹黄散能够上调3者的表达进而促进溃疡创面的愈合，且效果优于重组人EGF凝胶外敷。

综上所述，本实验使用中药丹黄散外敷能促进于糖尿病大鼠溃疡创面的愈合，可能是通过上调bFGF、EGF、VFGF的表达量的表达水平，促进成纤维细胞和新生毛细血管增殖,改善创面的血液循环,促进肉芽组织生长及肉芽组织在创面的填充,加快上皮细胞生长,最终加快创面愈合的进程。这为促进糖尿病溃疡创面愈合的药物开发提供了新的参考依据，也为丹黄散促进糖尿病溃疡创面愈合的作用机制提供新的理论基础。