三聚氰胺对雄性小鼠睾丸生精细胞凋亡的影响*

夏凤琼， 杨国珍， 黄健， 林明春， 肖礼红

(1.贵州省骨科医院 检验科， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学 医学检验学院， 贵州 贵阳 550004； 3.贵州医科大学附院 生化科， 贵州 贵阳 550004)

随着全球工业化的迅速发展，人类生殖健康受到的威胁日渐突出，男性精液质量下降十分显著[1]。三聚氰胺作为一种不可缺少的工业化学品，广泛地用于塑料、涂料、胶水、阻燃剂等行业，由于其含氮量高，再加上现有凯氏定氮法检测蛋白质含量的缺陷，许多不法分子便趁机将三聚氰胺添加于食品中来提高食品的含氮量[2]，从而威胁人类健康[3]。研究表明，三聚氰对宠物猫、狗及实验兔、鼠、猪具有一定的急性皮肤毒性、吸入毒性、眼睛刺激、肾脏毒性及肝脏毒性[4-9]；也有研究表明三聚氰胺可降低雄性小鼠体液免疫功能[10]，对雌性大鼠具有卵巢毒性[11]。关于三聚氰胺在生殖毒性方面的研究报道甚少，本研究以健康雄性昆明种小鼠为对象，用不同剂量的三聚氰胺通过灌胃对小鼠进行染毒，检测小鼠睾丸组织的病理变化、睾丸细胞凋亡百分率及凋亡相关蛋白bcl-2、bax、caspase-3的表达，初步探讨三聚氰胺对雄性小鼠的生殖毒性。

1 材料与方法

1.1 实验动物主要试剂和仪器

1.1.1实验动物 选择6～8周龄健康雄性昆明种小鼠50只，体质量25～30 g，购自于第三军医大学大坪医院野战外科研究所医学实验动物中心，许可证号SCXK(渝)2001-0005。

1.1.2主要试剂和仪器 三聚氰胺(Sigma 公司，美国)，环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司)，细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物发展有限公司)，流式细胞仪(美国Becton Dickingson公司)，Bcl-2、Bax免疫组化试剂盒(Santa Cruz 公司，美国)，Caspase-3免疫组化试剂盒(Cell Signaling公司，美国)，免疫组化二抗、AB显色系统(武汉博士德生物工程有限公司)，显微照相系统(四川大学Biomias图像分析软件)。

1.2 实验方法

1.2.1动物模型 将50只雄性小鼠随机均分为阴性对照组、实验组(三聚氰胺低、中、高剂量组)及阳性对照组。阴性对照组按0.1 mL/10 g体质量灌胃生理盐水，实验组分别按400、800、1 600 mg/kg体质量灌胃三聚氰胺，阳性对照组按40 mg/kg体质量腹腔注射环磷酰胺。各剂量组按照体重每天定时给药1次，连续5 d。

1.2.2标本采集 于第一次染毒结束后的第35天，颈椎脱臼处死小鼠，立即剪开腹腔取出两侧睾丸，用生理盐水洗净睾丸上的血液，滤纸擦干，左侧睾丸置于10% 中性甲醛中固定3 d后，常规取材、脱水、石蜡包埋制成切片；右侧睾丸-20 ℃保存 ，用于检测睾丸细胞凋亡。

1.2.3HE染色 左侧睾丸组织切片采用与脱水、透明相反的步骤脱蜡至水，苏木素溶液染色10 min，自来水冲洗10 min，1%盐酸酒精分色数秒，再经伊红染色。切片经乙醇梯度脱水，二甲苯透明后，中性树胶封片。光镜下观察小鼠睾丸组织结构。

1.2.4凋亡检测 细胞悬液的制备 取小鼠 右侧睾丸组织，剔除表面结缔组织，消去被膜，加入适量的PBS，用眼科剪将睾丸剪碎，吸管吹打混匀，100目尼龙网过滤，800 r/min离心5 min，弃上清液，组织沉淀用PBS洗2次，制成细胞悬液(浓度为105～107/ml)。细胞悬液中加入5 μL 标记有异硫氰酸荧光素(FITC)的Annexin V，再加入10 μL碘化丙啶(PI)，轻轻混匀、避光30 min，流式细胞仪检测，计算睾丸细胞凋亡率。

1.2.5免疫组化 左侧睾丸组织切片采用SABC法进行免疫组化染色，二氨基联苯胺(DAB)显色法检验。光镜下，细胞浆或细胞膜呈棕黄色为阳性表达。每张切片随机选取5个视野，测得Bcl-2、Bax、Caspase-3阳性表达的平均灰度值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 睾丸组织学

显微镜下结果显示，阴性对照组小鼠睾丸组织曲细精管完整、排列整齐，可见精原细胞和不同发育阶段的精母细胞、精子细胞及成熟精子，各级细胞排列紧密，层次分明(图1A)。三聚氰胺各剂量组睾丸形态结构随着染毒剂量的增加出现不同程度的损伤：低剂量染毒组损伤较不明显，各级生精细胞排列较有序，管腔中成熟精子数量减少(图1B)；中剂量染毒组可见生精细胞层数减少，管腔中精子数量减少(图1C)；高剂量染毒组生精细胞排列紊乱、疏松，层数减少，管腔中精子数量减少(图1D)；阳性对照组生精细胞层数减少，管腔中精子数量减少(图1E)。

图1 各组小鼠睾丸组织结构变化情况(HE，×400)Fig.1 Changes of testicular structure of mice in each group

2.2 蛋白Bcl-2 、Bax 及 Caspase-3表达

随着染毒剂量的增加，三聚氰胺低、中、高剂量染毒组Bcl-2阳性表达较阴性对照组逐渐减少(灰度值升高)，差异有统计学意义(P<0.05)；三聚氰胺中、高剂量组Bax、Caspase-3较阴性对照组其反应随染毒剂量增加而增强(灰度值降低)，差异有统计学意义(P<0.05)，与阳性对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。应用BioMias图像分析系统对各组实验结果进行检测。在40倍物镜下，每张切片随机选取5个视野(图2)，测得Bcl-2、Bax、Caspase-3阳性表达的平均灰度值。见表1。

注：箭头所示为阳性表达图2 各组小鼠睾丸组织中bcl-2、bax、caspase-3表达(SABC，×200)Fig.2 Expression of bcl-2, bax and caspase-3 in each group of mice testis

组别睾丸组织蛋白表达Bcl-2BaxCaspase-3阴性对照组127.84±12.95 133.06±11.36 149.75±5.33 阳性对照组150.98±7.86(1) 109.54±5.65(1)129.70±7.22(1)三聚氰胺低剂量组139.03±5.08(1)(2)129.17±9.08(2)145.65±5.06(2)三聚氰胺中剂量组139.90±5.56(1)(2)114.40±8.50(1)131.20±14.38(1)三聚氰胺高剂量组141.15±9.23(1)(3)112.14±6.25(1)133.45±4.21(1)

(1)与阴性对照组比较，P<0.05；(2)(3)与阳性组比较，P<0.05

2.3 睾丸细胞凋亡率

随着染毒剂量的增加，各实验组睾丸细胞凋亡率呈上升趋势，其中三聚氰胺高剂量组(23.404±3.488)与阴性对照组(16.871±3.610)比较，差异有统计学意义(P<0.05)，三聚氰胺低、中剂量组[(18.441±2.841)、(19.486±3.133)]与阴性对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

注：A为阴性对照组，B为三聚氰胺低剂量组，C为三聚氰胺中剂量组，D为三聚氰胺高剂量组，E为阳性对照组图3 各实验组睾丸细胞凋亡率Fig.3 Testicular cell apoptosis rate of different groups

3 讨论

检测化学品暴露对组织有无影响常采用的方法是病理学检查[12-13]。本次实验中所采用的化学暴露品是三聚氰胺，结果显示不同剂量的三聚氰胺对各组小鼠的睾丸组织产生了不用程度的病理损伤。其中，生理盐水(空白)对照组小鼠睾丸组织管腔内可见到大量成熟的精子细胞，生精小管及生精细胞排列规则、清晰；三聚氰胺低剂量组睾丸组织无明显的病理学变化；三聚氰胺中剂量组可见到睾丸组织管腔中生精细胞数量减少，层数减少，生精小管排列紊乱；高剂量组小鼠睾丸组织已发生明显萎缩。

细胞凋亡又称细胞程序性死亡(PCD)。正常的细胞凋亡过程对机体并无有害影响。但是外界的有害物质可使机体启动异常的凋亡程序，对机体产生不可逆的损伤。

虽然细胞凋亡是维持机体正常代谢所必须的，但是生精细胞的凋亡发生明显增加则可能影响精子的正常生成而引起不育[14]，各种理化因素增加睾丸生精细胞凋亡，常常引起睾丸组织发生损伤[15]。在本次研究中，各组小鼠暴露于不同剂量的三聚氰胺后睾丸生精细胞均发生的不同程度的凋亡，并且随着剂量的增加而增加。因此，本次研究表明，三聚氰胺可能诱导雄性小鼠睾丸生精细胞发生凋亡。

免疫组化结果表明，各剂量组小鼠睾丸组织促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表达均增加，中、高剂量组增加显著；而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达却明显降低。因此，本次研究中，雄性小鼠睾丸组织生精细胞的凋亡可能是抗凋亡蛋白Bcl-2的表达减少及促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表达增加有关。

综上所述，三聚氰胺对雄性小鼠具有一定的生殖毒性作用：睾丸组织结构发生病理损伤，管腔中生精细胞凋亡率增加，抗凋亡蛋白及促凋亡蛋白表达异常，从而可能进一步引起小鼠精液质量的下降和精子数量的减少，对雄性小鼠具有一定的生殖毒性作用。