端粒酶基因敲除小鼠行为学特征的增龄性变化研究

庄婉玉，黄晓真，卜婉萍，张志灿，林丽莉，林栋

（福建中医药大学，福建 福州 350122）

端粒酶基因敲除小鼠行为学特征的增龄性变化研究

庄婉玉，黄晓真，卜婉萍，张志灿，林丽莉，林栋

（福建中医药大学，福建 福州 350122）

目的通过对端粒酶基因敲除小鼠衰老特点的初步认识，为衰老领域的相关研究提供实验依据。方法分别选用2、3、5、7和9月龄的纯合子与同月龄的野生型端粒酶基因敲除小鼠相对照，从老化度评分、Morris水迷宫实验和自主活动实验等方面观察纯合子小鼠行为活动的增龄性变化。结果与野生型小鼠比较，纯合子小鼠随月龄增加其老化度评分呈升高趋势，且5、7和9月龄的老化度评分高于同龄野生型小鼠（P<0.05）；Morris水迷宫实验中，相比较野生型小鼠，纯合子小鼠定位航行试验的逃避潜伏期随月龄增加而有增长趋势，且7和9月龄的逃避潜伏期长于同龄野生型小鼠（P<0.05），而在空间探索试验的逃避潜伏期目标象限时间随月龄增加而呈下降趋势，与野生型小鼠比较差异有统计学意义（P<0.05）；自主活动实验结果显示，2、3和5月龄纯合子小鼠固定时间内自主活动次数与同龄野生型小鼠比较无显著变化，而7和9月龄纯合子小鼠与同龄野生型小鼠比较固定时间内自主活动次数减少（P<0.05）。结论与同龄野生型端粒酶基因敲除小鼠比较，纯合子端粒酶基因敲除小鼠随月龄增大，其行为活动出现明显增龄性变化，表现出系列衰老特征，尤其7和9月龄衰老表现更为明显。

端粒酶基因敲除小鼠；行为活动；增龄性变化；衰老

端粒酶基因敲除小鼠（telomerase-deficient，Terc-/-）是指野生型C57BL/J小鼠3号染色体的端粒酶基因组分用新霉素片段替换，其端粒酶表达缺失，其后代均表现出3～5 kb/代进行性端粒缩短和末端融合增快趋势，当端粒低于临界长度时会导致小鼠端粒功能紊乱[1-2]，进而表现出全身性多系统自然衰老征象，其皮肤、大脑、内脏和其他器官均发生老化，出现嗅觉衰退、不育、肠部和脾脏受损等疾病。

目前国内衰老领域的研究多使用快速老化小鼠（senescence accelerated mouse，SAM）或采用O3吸入、辐射和D-半乳糖等方法制造的衰老模型鼠，Terc-/-小鼠是国内衰老领域研究中较新颖的模型鼠，更接近自然衰老，更能真实地反应机体衰老的各种生理病理状态，是衰老相关研究的理想模型。为了将其更好地应用于衰老领域的研究，对其衰老特点的研究显得十分必要。本研究拟从老化度评分、Morris水迷宫实验和自主活动实验等方面考察Terc-/-小鼠行为活动的增龄性变化，从而初步了解该类小鼠的衰老特点，为衰老领域相关研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组

Terc-/-小鼠由上海茂生衍生物科技有限公司从美国杰克逊实验室代理引进（Stock#004132，货号No：MS13-127），置于福建中医药大学动物实验研究中心无特定病原体级转基因动物室进行保种、育种。待第3代无特定病原体级端粒酶基因敲除小鼠3～4周龄时行腮丛静脉采血，聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）法进行基因型鉴定，PCR产物长度转基因350 bp、野生型180 bp。根据PCR结果随机选出2、3、5、7和9月龄纯合子Terc-/-小鼠各8只，作为实验组；同时选用相同条件的同龄野生型Terc-/-小鼠各8只，作为正常对照组。见图1。

1.2实验方法

1.2.1老化度评分应用老化度评分表[3]从反应性、被动性逃避反应、皮毛光泽、皮毛粗糙度、脱毛程度、皮肤溃疡、眼周损害、角膜浑浊、角膜溃疡、白内障、脊柱后凸等11项指标对各组小鼠进行客观评分。每项指标划分为4～5级不等，标定分值。最后统计分值，积分越高表明其老化度越高。

图1　Terc-/-小鼠PCR鉴定结果

1.2.2Morris水迷宫实验Morris水迷宫测定系统由中国医学科学院药物研究所研制。实验装置主要由直径120 cm、高50 cm的圆形水池，直径12.5 cm、高28cm的圆形平台及图像采集记录装置组成。正式实验时，池内水深约30cm，高出平台1～2 cm，以防动物看到池内平台，水温保持（20±1）℃，将水池人为划分成4个象限，因Terc-/-小鼠毛发为黑色，故在实验过程中在其后背贴上白色防水胶布以助系统识别，示踪小鼠的运动轨迹。在正式实验前，已对Terc-/-小鼠进行水迷宫平台可视测试的预实验，即将平台露出水面约2cm，并在平台上放一红色旗帜，以增强平台可视度，从而排除该小鼠存在视觉及攀爬能力等方面的缺陷。实验时间为5d，单次实验时间设为60s，目标区域时间定为3s。第1～4天为定位划行实验，将平台放在第3象限，每天训练4次，小鼠分别从不同象限入水，观察小鼠在60 s内能否找到平台，如果能找到且在平台停留3 s以上，系统将自动终止实验并记录实验时间及运动轨迹等，若未找到实验将在第60秒自动终止，并将小鼠置于平台上停留10s，该阶段旨在考察动物的学习能力。第5天为空间探索实验，仅实验1次，将平台撤掉，小鼠固定从第1象限入水，观察小鼠60s内在第3象限时间等相关情况，以考察动物的记忆能力。见图2。

图2　Morris水迷宫实验过程

1.2.3自主活动实验小鼠自主活动程序自动控制仪由中国医学科学院药物研究所制造。仪器共设有6个独立空箱，6只小鼠可同时进行实验，实验时先将小鼠放入箱中适应5min后再测定，记录10min内小鼠的活动次数。

1.3统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用重复测量设计的方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1老化度评分结果

研究结果表明，纯合子和野生型小鼠老化度评分值均随年龄增长而增加。2和3月龄时两组差异无统计学意义（P>0.05），5、7和9月龄时，与野生型比较，纯合子小鼠的评分值增高，差异有统计学意义（P<0.05）。Terc-/-小鼠在1～9月生存期内，野生型并未出现明显的衰老表征，而纯合子在5月龄时即迅速出现明显的衰老征象，比野生型小鼠提前进入衰老期。见图3。

图3　不同月龄纯合子和野生型Terc-/-小鼠老化度评分的增龄性变化（±s）

2.2Morris水迷宫实验结果

实验中小鼠找到平台所用时间为逃避潜伏期，纯合子和野生型小鼠均在2、3、5、7及9月龄时进行Morris水迷宫实验，不同月龄纯合子和野生型小鼠的逃避潜伏期采用重复测量的方差分析。结果：①2、3及5月龄时的纯合子与野生型小鼠的逃避潜伏期比较，差异无统计学意义（F2月龄=8.751，P2月龄=0.593； F3月龄=0.023，P3月龄=0.876；F5月龄=3.560，P5月龄=0.688），②7、9月龄时的纯合子与野生型小鼠的逃避潜伏期比较，差异有统计学意义（F7月龄=0.098，P7月龄=0.001；F9月龄=4.158，P9月龄=0.000），纯合子小鼠的逃避潜伏期比野生型小鼠延长。见表1和图4。

表1　不同月龄纯合子和野生型小鼠的平均逃避潜伏期（n=8±s）

表1　不同月龄纯合子和野生型小鼠的平均逃避潜伏期（n=8±s）

组别2月龄3月龄5月龄7月龄9月龄纯合子44.00±7.86 47.71±6.43 48.91±8.05 50.74±6.06 50.98±3.14野生型42.37±3.11 48.26±7.18 47.65±3.26 38.53±5.58 35.77±7.13

图4　不同月龄纯合子和野生型小鼠逃避潜伏期的增龄性变化（n=8±s）

逃避潜伏期的目标象限时间比是指在第5天的空间探索实验中，小鼠在目标象限的时间占总时间的比值，采用重复测量的方差分析。不同月龄纯合子和野生型小鼠逃避潜伏期的目标象限时间比采用重复测量的方差分析。结果：①纯合子与野生型小鼠在2、3及5月龄时的目标象限时间比比较，差异无统计学意义（F2月龄=4.286，P2月龄=0.658；F3月龄=3.992，P3月龄=0.825；F5月龄=1.033，P5月龄=0.445）；②纯合子与野生型小鼠在7和9月龄时的目标象限时间比较，差异有统计学意义（F7月龄=0.665，P7月龄=0.009；F9月龄= 0.016，P9月龄=0.046），纯合子小鼠的目标象限时间比野生型小鼠减少。见表2和图5。

2.3自主活动实验结果

本次研究结果表明，两组小鼠在2、3和5月龄时的自主活动比较，差异无统计学意义（P>0.05），而7和9月龄时的自主活动比较，差异有统计学意义（P<0.05），野生型小鼠的自主活动随年龄增加无明显变化，而纯合子小鼠则随月龄增加而逐渐减少。见图6。

表2　不同月龄纯合子和野生型小鼠逃避潜伏期的目标象限时间比（n=8±s）

表2　不同月龄纯合子和野生型小鼠逃避潜伏期的目标象限时间比（n=8±s）

组别2月龄3月龄5月龄7月龄9月龄纯合子0.24±0.050.29±0.180.24±0.140.19±0.100.19±0.10野生型0.22±0.080.28±0.060.29±0.100.33±0.080.31±0.11

图6　不同月龄纯合子和野生型小鼠的自主活动

3 讨论

当今社会老龄化现象日益严重，有关衰老及衰老相关疾病的分子机制的研究日益受到关注。随着近年来对端粒和端粒酶的研究不断深入，发现端粒和端粒酶与衰老之间存在相关性，衰老的端粒学说也逐渐成为研究的热点。有研究表明[4]，1、2代Terc-/-小鼠表现出的早衰尚不明显，一般到第3代及之后端粒出现明显缩短，染色体端融合，进而出现寿命缩短、生殖力下降、组织萎缩及器官功能损害等早衰现象。Terc-/-小鼠中枢神经系统则表现为脑部缩小，大脑早衰，海马区BDNF表达低于正常，且易引起阿尔茨海默症、帕金森病等脑部衰老性疾病[5-9]。笔者尚未阅读到国内用Terc-/-小鼠来进行中枢神经系统退行性病变的研究报道，试图以该Terc-/-小鼠为模型，研究该小鼠的行为学变化。

老化度评分是根据小鼠的外在表现及行为变化来评定其机体的老化程度，它反映机体的衰老征象[3]，从本次的研究结果看，不同基因型Terc-/-小鼠随月龄的增加所表现出的衰老征象不同，纯合子和野生型小鼠在2和3月龄时评分差异无统计学意义，而5、7和9月龄时纯合子小鼠得分均明显高于野生型小鼠，表明纯合子小鼠一般在5月龄以前尚未表现出衰老征象，在经过一段相对正常的生长期后，大约在5月龄时开始有别于正常小鼠，进入快速衰老期而出现明显的衰老征象。

Morris水迷宫实验旨在检测动物空间搜索和辨别的学习记忆能力，以动物找到隐藏于水中平台的潜伏期和动物在目标象限的探索时间等多项指标来评定动物的学习记忆能力[10]。本次研究结果显示，在5月龄及5月龄前，纯合子和野生型小鼠的学习记忆能力差异无统计学意义，但7月龄及7月龄以后，纯合子小鼠与野生型小鼠比较，潜伏期明显延长，探索过程中在目标象限的时间明显减少，表明其学习记忆能力较野生型小鼠明显下降。

自主活动实验是通过测试动物在一定时间内的活动次数，反应动物的中枢神经系统功能状态，一般动物的中枢神经系统兴奋时活动次数增加，抑制时则活动次数减少[11]。本次研究结果显示，纯合子和野生型小鼠的自主活动在2、3和5月龄时差异无统计学意义，而在7和9月龄时两组间差异有统计学意义，纯合子小鼠自主活动随月龄增加逐渐减少，说明纯合子小鼠随月龄的增加中枢神经系统兴奋性逐渐降低，尤其在7月龄及以后更明显。

上述研究结果证实，纯合子Terc-/-小鼠与野生型Terc-/-小鼠相比，其外在体征、学习记忆能力及自主活动等均出现了增龄性的快速衰老现象，且衰老多发生在7月龄以后。Terc-/-小鼠是一种自然衰老模型，能更真实地反应机体的衰老状态，可作为衰老领域研究的理想衰老模型，在衰老机制、治疗等方面的研究中具有很好的应用前景。

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（申海菊编辑）

Aging changes of behaviour characteristics in telomerase knockout mice*

Wan-yu Zhuang，Xiao-zhen Huang，Wan-ping Bu，Zhi-can Zhang，Li-li Lin，Dong Lin（Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou，Fujian 350122，China）

Objective To systematically study aging changes of behavior characteristics in the telomerase knockout mice，so as to provide experimental basis for research in the field of aging using the model mice. Methods Homozygote telomerase knockout mice of 2，3，5，7 and 9 months were selected and compared with wild telomerase knockout mice of the corresponding age.The aging changes of behavior characteristics in the homozygote mice were observed from aging degree score，Morris water maze experiment and independent activity experiment.Results Compared with the wild type mice，the homozygote mice showed an increasing trend of aging degree score，which was specially obvious in the mice of 5，7 and 9 months compared with the wild type mice of the corresponding age（P＜0.05）.In the Morris water maze experiment，compared with the wild type mice，the homozygote mice had a growing trend in sea trial with the increase of months，the escape latency of the 7-and 9-month homozygote mice was significantly longer than that of the wild type mice of the corresponding age（P＜0.05）；while in the space exploration trial the escape latency of the target quadrant showed a downward trend with increasing month age，which was statistically different from that of the wild mice（P＜0.05）.The independent activity experiment revealed，there were no significant changes in the number of autonomic activities within a fixed time between the homozygote mice and the wild type mice

telomerase knockout mice；behavior activity；aging change；aging

R 339.38

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.19.001

1005-8982（2016）19-0001-05*of 2，3 and 5 months，while the number of autonomic activities within a fixed time in the homozygote mice of 7 and 9 months was significantly reduced compared to the wild mice of the corresponding age（P＜0.05）. Conclusions Compared with wild type telomerase knockout mice of the same age，the homozygote mice have apparent aging changes in their activities，and show a series of aging characteristics，particularly in mice of 7 and 9 months.

2016-05-11

国家自然科学基金（No：81273672）；福建省卫生系统中青年骨干人才培养项目（No：2014-ZQN-JC-28）；福建省自然科学基金（No：2014J01353）

林栋，E-mail：bluelike1@sina.com