载脂蛋白E基因多态性与主观认知减退的相关性*

胡勇， 刘芳*

(贵州医科大学 神经病学教研室， 贵州 贵阳 550004)

阿尔兹海默症 (alzheimer’s disease，AD)俗称老年痴呆症，是一种病程缓慢的认知障碍性疾病，以脑内β-样淀粉蛋白沉积、神经原纤维缠结为主要的病理生理学改变为特征[1]。研究表明，在中国>65岁的人群中，痴呆的患病率约4.98%～5.9%，随着年龄的增长，痴呆和AD在中国的患病率显著上升[2]。AD分为主观认知减退(subjective cognitive decline，SCD)、轻度认知障碍期 (mild cognitive impairment，MCI)及痴呆期 (dementiaof Alzheimer’s type，DAT)3个阶段[2-3]。Jessen等[4]提出，主观认知减退是指个体自感存在记忆或者其他认知功能较前出现下降．但无客观神经心理检测缺损的证据。近年来SCD的相关研究成为认知障碍研究的热点，脑脊液、结构或功能磁共振、甚至FDG-PET和PIB-PET均有报告证实SCD阶段 确实存在AD相关病理改变[5]。多项研究证实载脂蛋白E基因(Apo lipoprotein E gene，ApoE)与AD及MCI 阶段密切相关[6-7]，ApoEε4等位基因是阿尔兹海默症发病的一个独立危险因素。本文探讨SCD患者与正常老年人的Apo E基因多态性，分析其与SCD的相关性,旨在为SCD的防治提供依据。

1 资料与方法

1.1 对象与入组标准

从2016年9月～2017年9月神经内科住院及门诊就诊患者中选取≥60岁SCD患者130例为SCD组，另选取同期体检的健康人120例健康者为对照组；SCD组中男75例、女55例，60～83岁、平均(72.8±8.1)岁；对照组中男68例、女52例，61～85岁，平均(73.1±8.6)岁。两组被检者年龄、性别等资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。SCD入组标准：(1)记忆减退主诉的评定采用Lam等[8]开发的中国记忆症状量表 (chinese memory symptoms scale，CMSS)，该量表包括“您是否经常遗忘物品的摆放位置”、“无法想起好朋友的姓名”、“对谈话的内容无法想起”、“有主观记忆问题”及“明显感觉自己的记忆力比同龄其他老人差”5个条目，如果2个以上条目均回答有，则认为有主观记忆减退；(2)认知功能的评定采用简易智力状态检查量表及北京版蒙特利尔认知评估量表，两量表均采用按文化程度校正的临界分值标准，即MMSE得分中学或以上(受教育年限>6年)者≤24分则视为存在认知功能障碍、27～30分为正常，MoCA得分中学或以上(受教育年限>6年)者≤24分视为有认知功能障碍、≥26分认知正常(本研究以受教育程度为中学以上为对象进行对照研究，故以MMSE≥27分，MoCA≥26分排除认知功能障碍)；(3)日常生活能力量表(ADL)<26分，排除日常生活受损；(4)焦虑自评量表(SAS)<50分，抑郁自评量表(SDS)<53分，排除焦虑抑郁情绪对认知的影响；(5)符合纳入标准。正常对照组入组标准：(1)无记忆减退主诉，(2)MMSE≥27分、MoCA≥26分。

1.2 方法

1.2.1标本采集 对两组被检者，均抽取晨起7时空腹外周静脉血2 mL，采用3.8%柠檬酸钠抗凝，将白细胞基因组DNA通过盐析法提取，放置于-20 ℃的冰箱中储藏。

1.2.2ApoE 基因多态性检测 将提取出来的基因进行扩增，使用Primer Premier5软件设计及并合成ApoE基因的引物，上游引物序列为5′-AGGAACAACTGACCCCGGT-3′，下游引物为5′-TGCTCCTTCACCTCGTCCA-3′。聚合酶链反应(PCR)体系50 μL，Prem Taq(Ex Tag Version)2.0D331A 12.5 μL，基因组 DNA0.3 μg，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，加灭菌蒸馏水定容至50 μL。PCR反应条件: 95 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，57 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，35个循环后，72 ℃继续延伸6 min后降至4 ℃。PCR产物经纯化回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司SK1141) 纯化后，对靶基因进行直接测序，采用的仪器是3730序列分析仪，得到不同ApoE基因型。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg 吻合度检验

两组的ApoE基因型频率及等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，具有较好的吻合度 (χ2=4.78、2.35，P>0.05) 。见表1。

表1 Hardy-Weinberg遗传平衡检验Tab.1 Hardy-Weinberg genetic balance test

2.2 ApoE 基因型分布

分析两组被检者ApoE基因型多态性，最常见的基因型是ε3/ε3，SCD组为64.61%、对照组为67.86%，SCD组ε3/4(18.46%)及ε4 /4(6.15%)基因型频率高于对照组(14.17%、0.90%)，差异有统计学意义(χ2=4.139、4.173，P<0.05)。见表2。

表2 SCD组与对照组被检者ApoE基因型频率分布Tab.2 Frequency distribution of ApoE genotypes in SCD group and control group

2.3 ApoE 等位基因频率

比较两组被检者ApoE等位基因分布频率可见，SCD组和对照组ε4等位基因频率分别为17.69%、7.91%，两组比较差异有统计学意义(χ2=4.421，P=0.036)，两组被检者ApoE等位基因频率均以ε3最高(SCD组为75%，对照组为81.67%)，见表3。

表3 SCD组与对照组被检者ApoE等位基因频率Tab.3 Frequency distribution of ApoE allele in SCD group and control groups

2.4 ApoE 等位基因频率风险

通过计算OR值估计ApoE基因与SCD的关系，结果证明ApoEε2、ε3 等位基因与SCD发病无显著相关性。ApoEε4等位基因与SCD呈正相关性，见表4。对于年龄、性别混杂因素影响，在统计分析中进行了Logistic回归校正，最大限度地控制了混杂因素影响。见表5。

表4 ApoE 等位基因频率与SCD风险分析Tab.4 The risk analysis of the relationship between ApoE allele frequency and SCD

3 讨论

认知功能损伤是AD的主要表现，其病因及具体的发病机制未明，在进行早期诊断时容易误诊和漏诊，临床治疗上存在较大的困难和差异。最近的一项纵向研究表明SCD是未来认知功能障碍和认知障碍发展的预测因子[9]。临床中，在老年人MMSE及Moca等相关认知量表评测上还没有表现出明显认知下降时，就针对患者的病情做出有效的护理和防治对延缓患者的病情蔓延和发展具有十分重要的意义，对早期预防阿尔兹海默症及治疗具有重大意义[10]。

多项临床随访研究均证实SCD与AD的转归相关。Meta分析研究比较了28项SCD相关随访结果后发现SCD较对照组发展为痴呆的风险约2倍[11]。SCD发展为痴呆和MCI的年转化率分别为2.3%和6.6%[12]。国外对 SCD 的研究已进入到概念的提出、评估方法的制定、SCD 行为的改变[13]，甚至是干预方法的探索[14]等方面。目前国内进行ApoE的多态性与MCI及AD相关性的研究较多，而比较与SCD相关性文章较少，这也是开展本项研究的意义所在。ApoE基因位点具有多态性这一结论是1975年一名外国的学者在进行电聚焦实验时发现的。目前比较统一的说法是由于年龄、种族和区域的不同，ApoE等位基因的分布频率也不同。ApoE的3种等位基因在自然人群的分布频率为ε3占大多数，为70%～80%，ε2和ε4分别占5%～10%和10%～15%[15]。目前认为机体血清中的Ch和脂质的代谢受到ApoE基因的影响从而产生各种疾病。

为了进一步探讨ApoE与SCD发病率之间的关系，本研究重点比较SCD患者与正常老年人的ApoE基因多态性。曾有相关研究对患者与健康受试者的ApoE基因数据进行回顾性分析，结果表明，SCD患者的ε4 基因频率明显增高，提示其可能与SCD患病存在相关性[16]。在本研究发现两组Apo E基因型多态性相比，SCD组被检者ε3/4(18.46%)及ε4/4(6.15%)基因型频率高于对照组(14.17%，0.90%)(χ2=4.139,4.173，P<0.05)，ε3/ε3是最常见的基因型(SCD组为64.61%，对照组为67.86%)。在等位基因多态性分布频率比较中，结果显示SCD组和对照组被检者ε4 等位基因频率分别为 17.69%、7.91%，两者比较差异具有统计学上的意义(χ2=4.421，P=0.036),ε3是最常见的等位基因，其中SCD组被检者为64.61%，对照组为67.86%。这一结果支持ApoEε4基因与SCD患病存在可能联系。

本研究通过风险分析提示ApoEε4等位基因与SCD呈正相关性(OR=1.922)，混杂基因校正后OR=2.011。携带 Apo Eε4 等位基因者患SCD的可能性是未携带者的2.24倍，推测ApoEε4等位基因可能是SCD患病的风险因子之一。有报道发现SCD的患病率与ε4 基因的个数呈正相关，家族性的SCD患者中随着ε4基因的个数增加，SCD的患病率甚至可增至90%[17]，这与本研究结果相似。

综上所述，ApoEε4基因是SCD患病的重要危险因素，ε4基因个数的增加会提高SCD的患病率。通过检测ApoE等位基因，早期识别SCD，从SCD阶段进行干预，国外一些相关研究表明，某些药物及非药物治疗可能会有一定的作用，如神经节苷脂临床试验、对SCD患者进行冥想训练及正念训练(mindfulness training)，可能对SCD向MCI甚至AD转化有一定的延缓作用[18-20]。