菜籽粕固体发酵及其理化性质的研究

■李莉娜 张林鑫 张凯凯 陈浩林 粟朝芝 吴 仙

(贵州省畜牧兽医研究所，贵州贵阳550003)

菜籽粕是油菜籽提油之后的副产物，粗蛋白质含量约35%～45%，氨基酸组成相对均衡，且Ca、Mg等矿物质及维生素B、胆碱等维生素含量高，是一种具较高营养价值的植物蛋白资源[1]。然而因天然饼粕中含有多种抗营养因子，所以限制了菜籽粕在饲料工业的应用，相当一部分还被加工成有机肥料使用，大大浪费了菜籽粕营养价值的利用[2]。为了去除菜籽粕中硫甙、植酸、单宁等有毒物质和抗营养因子，提高其在动物饲料中的饲用价值，国内外学者进行了大量的研究。目前，在众多处理方法中，固态发酵菜籽粕已成为研究热点。很多研究报道表明微生物固态发酵可以改善菜籽粕的营养特性或饲用价值[3-6]。由于各原料的营养特性和实际应用的限制因素不同及发酵所选用的菌种或发酵方式不同，改善效果也存在不一致[7-8]。因此，本试验以菜籽粕为底物，选用枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、粪链球菌等菌种，通过单菌株与混菌株固体发酵试验，研究菜籽粕发酵产品的理化性质。旨在通过菜籽粕的微生物固态发酵改善其营养价值，为其在动物饲料中的合理使用提供基础参数。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菜籽粕、玉米粉和麦麸：菜籽粕购自贵州金瑞农业科技有限公司，麦麸和玉米粉购自贵州五斗米商贸有限公司，烘干，用高速超微粉碎机粉碎，过60 目筛保存备用。

无水氯化钙：分子式CaCl2，分子量110.9，纯度≥96.0%，成都金山化学试剂有限公司。

氯化铵：分子式NH4Cl，分子量53.49，纯度≥99.5%，天津市永大化学试剂有限公司。

1.2 菌种

查阅文献选择枯草芽孢杆菌、黑曲霉、酿酒酵母、植物乳杆菌和粪链球菌发酵菜籽粕，分别在中国食品发酵工业研究院(中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC)和中国农业微生物菌种保藏中心(ACCC)购买，具体参数见表1。

表1 5种菌的基本信息

1.3 培养基

1.3.1 菌种活化培养基

①枯草芽孢杆菌活化培养基：麸皮50.0 g、豆饼粉30.0 g。上述成分混合后，加0.2%NaOH溶液1.0 L，煮沸1 h，用HCl中和到pH值7，然后加琼脂20.0 g，熔化后，分装灭菌。37 ℃培养1～2 d。

②植物乳杆菌活化培养基：酪胨10.0 g、牛肉粉8.0 g、酵母粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、硫酸镁0.2 g、乙酸钠5.0 g、柠檬酸三铵2.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、硫酸锰0.05 g、吐温80 1.0 g，蒸馏水1 000 ml。pH 值6.2±0.2。37 ℃培养1～2 d。

③酿酒酵母活化培养基：5°Bé 麦芽汁琼脂(青岛海博生物技术有限公司HB4176-2)1.0 L，琼脂15.0 g制备，自然pH值。28～30 ℃培养3 d。

④粪链球菌活化培养基：酪蛋白胨10.0 g、牛肉提取物10.0 g、酵母提取物5.0 g、葡萄糖5.0 g、乙酸钠5.0 g、柠檬酸二铵2.0 g、吐温801.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、7 水硫酸镁0.02 g、1 水硫酸锰0.05 g、碳酸钙20.0 g、琼脂15.0 g、蒸馏水1.0 L。pH 值6.2±0.2。37 ℃培养1～2 d。

⑤黑曲霉活化培养基：马铃薯提取液1.0 L，葡萄糖20.0 g、琼脂15.0 g，pH 值自然。马铃薯提取液：取去皮马铃薯200 g，切成小块，加水1.0 L煮沸30 min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1.0 L。28～30 ℃培养5～7 d。

1.3.2 固体发酵培养基

在250 ml三角瓶中加入菜籽粕20 g、CaCl20.1%、NH4Cl 1.5%、玉米粉0.5%、麦麸0.5%、料水比1∶1.2搅拌均匀，121 ℃高压灭菌15 min后备用。

1.4 试验方法

1.4.1 单菌固体发酵菜籽粕试验

将枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母、粪链球菌、黑曲霉打管复活，分别在液体培养基扩大培养，按30%接种量分别接种到固体发酵培养基中，搅拌均匀，密封放入30 ℃培养箱中连续恒温培养3 d，设3个重复。发酵产品在35 ℃烘干，粉碎过60 目筛备用。测定有益菌活菌总数、真蛋白质量分数、硫苷含量、多肽得率、氨基酸和单宁含量，同时测定原料真蛋白质量分数、硫苷含量、氨基酸和单宁含量。

1.4.2 混菌固体发酵菜籽粕试验

根据单菌发酵试验测定指标的结果，选择真蛋白质量分数较高、硫苷含量最低和多肽得率最高的4个菌种，分别在液体培养基扩大培养，合理组合(双菌、三菌、四菌)，分成10 个菌种组合，按1∶1，1∶1∶1，1∶1∶1∶1的比例、30%总接种量接种到固体发酵培养基中混合发酵，搅拌均匀，密封放入30 ℃培养箱中连续恒温培养3 d，设3个重复。发酵产品在35 ℃下烘干，粉碎过60目筛备用。测定其有益菌活菌总数、真蛋白质量分数、硫苷含量、多肽得率、氨基酸和单宁含量。

1.5 检测方法

有益菌活菌总数参照刘宝生等(2011)[9]枯草芽孢杆菌活菌数的测定方法；氨基酸含量参照NY/T 1582—2007 油菜籽中硫代葡萄糖苷的测定高效液相色谱法[10]；真蛋白质量分数参照王俊峰(2004)[11]饲料中真蛋白质含量的测定方法；硫苷含量参照汪正华(2000)的氯化钯分光光度法[12]；单宁含量参照GB/T 27985—2011饲料中单宁的分光光度测定方法[13]；多肽得率参照鲁伟(2005)蛋白水解液中多肽含量的测定方法[14]。

1.6 数据分析处理

利用SAS 9.1 软件进行数据的差异显著性检验，各指标以“平均数±标准差”表示。各组间差异显著性用Duncan's 方法进行比较。指标差异显著判断标准为P＜0.05。

2 结果

2.1 原料理化分析结果

原料菜籽粕在干物质基础上，粗蛋白为34.97%、粗脂肪为4.63%、灰分为7.23%、钙为0.67%、磷为1.32%、真蛋白质量分数为31.81%、氨基酸含量271.17 mg/g、硫苷含量22.51 μmol/g、单宁的含量11.36 μg/g。

2.2 单菌株发酵产品理化分析结果

单菌株发酵菜籽粕结果见图1、图2、图3、图4、图5、图6，发酵后有益活菌总数从大到小为：D＞A＞C＞E＞B，酿酒酵母比其他菌种发酵后有益活菌总数高，为3.85×107cfu/g(P＜0.05)达到差异显著水平；各单菌株发酵后真蛋白质量分数为：A＞E＞D＞C＞B，枯草芽孢杆菌发酵真蛋白质量分数最高为39.51%，与原料相比提高了7.7 个百分点；发酵后氨基酸含量从大到小为：A＞C＞E＞D＞B，枯草芽孢杆菌发酵后氨基酸含量最高为296.41 mg/g，与原料相比提高了25.24 个百分点；发酵后多肽得率从大到小为：C＞D＞A＞E＞B，粪链球菌发酵后多肽得率最高为16.04%，与D 差异不显著，但与A、B、E 之间差异显著(P＜0.05)；发酵后硫苷含量从大到小为：B＞E＞C＞D＞A，其中枯草芽孢杆菌和酿酒酵母具有较高的硫苷降解能力，两者之间差异不显著，但与未发酵菜籽粕的硫苷含量相比，硫苷降解了10.68 个百分点；发酵后单宁含量从大到小为：B＞A＞C＞D＞E，黑曲霉发酵后最低为7.519 7 μg/g，与原料相比降低了3.84 个百分点。综合上述结果，选择降解硫苷能力强的A、有益活菌总数多的D、生产多肽最多的C 以及降解单宁强的E，进行双菌、三菌、四菌混菌发酵试验。

图1 单菌株发酵有益活菌总数

图2 单菌株发酵真蛋白质量分数

图3 单菌株发酵总氨基酸含量

图4 单菌株发酵多肽得率

图5 单菌株发酵硫苷含量

图6 单菌株发酵单宁含量

2.3 混菌株发酵产品理化分析结果

混菌株发酵菜籽粕见图7、图8、图9、图10、图11、图12，有益活菌总数中，B+C+D 组合最高为5.89×107cfu/g，其次C+D为5.50 cfu/g、A+B+C为5.22 cfu/g、A+B+D为4.54 cfu/g，四者之间差异不显著，但与其他组合相比，达到差异显著水平（P＜0.05）；真蛋白质量分数中，A+B 组合最高为45.79%，其次A+B+C+D 为45.69%，A+D 为45.68%，三个组合之间差异不显著，但与其他组合相比，均达到差异显著水平（P＜0.05）；氨基酸含量中，最高的组合是A+B+C+D为331.48 mg/g，其次B+C+D 组合为330.10 mg/g，两者之间差异不显著，但与其他组合相比，均达到差异显著水平（P＜0.05）；多肽得率最高的C+D组合为26.31%，其次B+D为24.78%，两者之间差异不显著，但与其他组合相比，均达到差异显著水平（P＜0.05）；硫苷含量中，降解能力最强的A+B+C+D 组合达到10.32 μmol/g，其次是B+C+D 为10.56 μmol/g、A+B+D 为11.21 μmol/g，三者之间差异不显著，但与其他组合相比，均达到差异显著水平（P＜0.05）；单宁含量中，降解最强的A+B+C+D组合达到5.61 μg/g，其次是A+B 为5.62 μg/g、B+C+D 为5.63 μg/g、A+B+D为5.69 μg/g，四者之间差异不显著，但与其他组合相比，均达到差异显著水平(P＜0.05)。

图7 混菌株发酵有益活菌总数

图8 混菌株发酵真蛋白质量分数

图9 混菌株发酵氨基酸含量

图10 混菌株发酵多肽得率

图11 混菌株发酵硫苷含量

图12 混菌株发酵单宁含量

3 讨论

3.1 单菌发酵试验对菜籽粕的影响

枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用。本研究表明枯草芽孢杆菌发酵菜籽粕的效果显著优于其他单菌，真蛋白质量分数提高了39.51%，总氨基酸含量提高了9.31%，可能是菌株利用氮源合成了菌体蛋白的原因。多肽得率为15.27%，硫苷为45.51%，这与何荣海等[15]用枯草芽孢杆菌固态发酵菜籽粕生产多肽及降解硫苷的研究结果接近，多肽得率15.94%，硫苷降解率可达62.14%。菜籽粕经过植物乳杆菌、黑曲霉处理后其抗营养因子均得到大幅度降解，其中黑曲霉的降解率高于植物乳杆菌，在改善菜籽粕营养品质方面植物乳杆菌效果优于黑曲霉。这与邱良伟等[16]的研究报道一致。

3.2 混菌发酵试验对菜籽粕的影响

混菌发酵的原理是利用微生物种类多，数量大，繁殖快，易培养，酶系复杂等特点，采用发酵技术来去除菜籽粕中的抗营养因子[17]，不仅可以去除大部分抗营养因子，而且混菌发酵效果显著优于单菌发酵效果[18]。本研究发现，B+C+D 组合有益活菌总数最高为5.89×107cfu/g；A+B组合的真蛋白质量分数最高为45.79%；A+B+C+D 组合的氨基酸含量最高为331.48 mg/g；C+D 组合的多肽得率最高为26.31%；A+B+C+D 组合降解硫苷能力最强达到10.32 μmol/g；A+B+C+D组合降解单宁最强的达到5.61 μg/g。与原料菜籽粕相比，真蛋白质量分数提高了13.98 个百分点，氨基酸含量提高了18.19%，硫苷含量降低了54.15%，单宁的含量降低了50.62%。这一结果与前人的研究不一致，张宗舟等[19]通过发酵法可使菜籽粕单宁分解率达到93.7%；孙林[20]采用植物乳酸菌、蜡样芽孢杆菌、酪酸梭状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌添加麸皮发酵菜籽粕48 h，菜籽粕单宁去除率达77.3%；胡永娜等[4]利用枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和啤酒酵母三菌种组合发酵菜籽粕。菜籽粕硫苷93.44%、单宁降解率34.86%。可能是因为多菌发酵时多菌体系中微生物生长状况良好，使发酵产物中的菌体数目增多。但是单宁含量没有明显降低，原因可能有两个：一是因为试验保证总接种量不变，每种菌的接种量相对减少，因此影响了发酵的总体效果；二是因为菌种之间可能存在拮抗作用。硫苷的降解效果明显，主要是霉菌和酵母菌混合培养时，酵母能较快地利用基质中的可发酵性糖生长繁殖合成菌体蛋白，起到解除终产物阻遏作用，使霉菌能不断分泌产生淀粉酶、糖化酶、纤维素酶等，从而有效地分解碳水化合物，提高了硫苷的降解率。

4 结论

①单菌发酵中，枯草芽孢杆菌发酵效果显著优于其他单菌，明显提高了真蛋白质量分数和氨基酸含量，降低了抗营养因子含量。

②混菌发酵中，枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、粪链球菌和黑曲霉的四菌组合发酵效果最好。