甜柿单宁的分布及积累特征分析

张超越，李海刚，辛杰，张桂芝，王守箐，刘林

（临沂大学药学院，山东临沂 276005）

单宁是植物次生代谢产物[1-3]，可分为水解性与非水解性两种类型[4-7]，前者分子量较小，可发生水解反应[6-7]，后者分子量较大，不发生水解反应[8-9]。单宁是一类生物活性分子，具有抗氧化、杀菌、抑制肿瘤、保护心血管等作用，在食品、饲料、化妆品、医药等许多领域都有开发应用[10-14]。葡萄酒具有抗氧化活性就是因为它含有单宁，单宁是葡萄种皮、果皮或果柄发酵过程中释放到酒里的，或是贮藏于橡木桶中的酒从橡木中萃取的[10]。因此，研究植物单宁积累的特征不仅具有植物学理论意义，也能为植物单宁开发应用提供参考。

柿果实分为涩柿和甜柿两种类型[15]，涩柿积累大量单宁，成熟软化前食用口感极差，必须经自然光照或通过化学药品等措施使单宁变性，涩味才能大大减轻或消失。定量检测表明甜柿含少量单宁[15]，但对单宁在果实中的积累特征还缺少显微观察。为了解甜柿果实中单宁在什么类型组织中积累，所在的积累细胞以及在细胞的积累空间，本研究用组织化学方法和透射电子显微技术对甜柿果实中的单宁积累进行了显微分析。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试植物柿（Diospyros kaki）为甜柿，品种为富有，栽种于临沂大学教学实习基地。为避免果实成熟后单宁已经发生自然变性而不易进行显微检测，于8 月中旬取未成熟果实进行单宁积累特征的显微分析。选3 个地点，每个地点选3 棵树，从每棵树上随机取6 个果实。

1.2 透射电子显微技术

具有邻位二羟基的酚类化合物与四氧化锇强烈反应，产生稳定的络合物，在透射电子显微下呈现出高电子密度[16-17]。从未成熟的柿果实上取小于1 mm3的小块，用2.5%戊二醛溶液（用0.05 mol 磷酸缓冲液配制）固定12 h，再用1%四氧化锇溶液固定4 h，酒精脱水，Epon-812 树脂包埋，切片，厚度为60 nm，醋酸铀和柠檬酸铅双染，透射电镜下观察单宁。

1.3 组织化学法

单宁与四氧化锇反应，产物在光学显微镜下呈现棕色至黑色[17-18]。将柿果肉小块固定后在四氧化锇溶液中浸泡4 h，之后包埋于树脂中，切片，厚度1 μm，显微镜下观察单宁。

利用单宁与三氯化铁反应产生蓝绿色的性质，从未成熟果实上取果肉，用戊二醛溶液固定后在三氯化铁溶液中浸泡12 h，然后包埋于树脂中，切片，厚度1 μm，显微镜下观察单宁。

2 结果与分析

2.1 柿果实显微特征

柿果实肉质，为浆果。果肉由维管组织和贮藏组织组成，具体见图1A～D，维管组织没有维管束鞘包围，由木质部和韧皮部构成，韧皮部较发达，占比较多，而木质部相对较小，占比较少。图1A、B、D 显示，维管组织细胞排列紧密，没有细胞间隙，细胞较小，长5～20 μm，宽3～15 μm，外围的细胞较大，内部的细胞较小；木质部细胞较大，韧皮部细胞较小。

与维管组织相比，贮藏组织细胞排列较疏松，细胞间隙较明显，细胞体积较大，但不同位置的细胞大小有明显差异，靠近维管组织的细胞较小，长50～70 μm，宽40～50 μm；远离维管组织的细胞较大，长80～160 μm，宽60～100 μm（图1A～D）。

贮藏组织细胞高度液泡化，液泡占据细胞绝大部分空间（图1A～D）。维管组织中较大的细胞高度液泡化（图1A～D），较小的细胞液泡化程度低，含有较多细胞质（图1E、F）。

2.2 果肉中单宁的积累特征

2.2.1 贮藏组织中的单宁积累

基于四氧化锇和三氯化铁鉴定分析，贮藏组织中约有4%的细胞积累单宁，单宁几乎充满细胞，细胞质极少。图1A、C、D 显示积累单宁的细胞出现在维管束周围，或在远离维管束的位置。细胞中的单宁在液泡内积累，不会向周围细胞转移。

图1B、C 显示，单宁不仅在细胞中积累，也在贮藏组织细胞间隙积累，充满局部区域的细胞间隙。通常是维管束韧皮部一侧的贮藏组织细胞间隙积累单宁，而木质部一侧的贮藏组织细胞间隙少有单宁积累，显示贮藏组织细胞间隙单宁积累与韧皮部密切相关。果实韧皮部是来自光合器官同化物向贮藏组织卸载的场所，与韧皮部相邻的贮藏细胞优先获得光合同化物。

2.2.2 维管组织中的单宁积累

维管组织多数细胞不积累单宁，只有很少数维管薄壁细胞积累单宁，单宁细胞约占维管组织细胞总数的5%（图1B、D、E）。多数维管束横切面上可见单宁细胞，2个或4 个聚集在一起（图1A、B），但个别维管束横切面上不出现单宁细胞（图1D）。单宁在中央大液泡内积累，充满单宁细胞内部空间，细胞质极少。与单宁细胞相邻的维管薄壁细胞不积累单宁（图1F），表明单宁被限制在液泡内，不会从一个细胞向另一个细胞扩散。维管组织没有细胞间隙，不发生细胞间隙单宁积累。

图1 甜柿果肉中单宁的积累Fig.1 Tannin accumulation in non-astringent persimmon fruits

3 讨论

本研究分析了甜柿果实中单宁积累特点，结果显示，其既在叶肉组织少部分细胞中积累，也在维管组织少部分细胞中积累；既在细胞内部的液泡中积累，也在细胞细胞外部即细胞间隙中积累。该研究结果揭示了甜柿果实中单宁积累的特征，从显微水平上证实了甜柿仍然含有少量单宁，与用吸收光谱和色谱分析等技术手段的研究结果一致[15]。

细胞内部合成单宁的场所是单宁体[19]，单宁体是一种起源于叶绿体类囊体膜的细胞器，单宁合成后转移到液泡。但单宁体并不是单宁合成的唯一场所，有研究用抗五没食子酰葡萄糖抗体和抗没食子转移酶的抗体进行免疫定位，发现细胞壁上存在这种酶的活性[7]，这种酶是水解性单宁合成所需要的酶，由此证明细胞壁也是单宁合成的场所，葡萄糖和没食子酸由细胞分泌到细胞壁中并在那里合成单宁。甜柿单宁既在液泡内积累，也在细胞间隙积累，液泡和细胞间隙是完全不同的环境。细胞间隙是细胞外空间，这里的单宁由细胞中的单宁体合成并分泌而来，或者在细胞壁中合成并扩散出来，但要证明其准确来源尚需要更多研究。