八月瓜叶、果皮和果肉中酚类、VC含量及其抗氧化能力分析

刘永玲，谢国芳，，王威，杨双双，赵治兵

（1.贵阳学院食品与制药工程学院，贵州 贵阳 550005；2.贵州省果品加工工程技术研究中心，贵州 贵阳 550005）

八月瓜（Akebia trifoliate（Thunb.）Koidz.）为木通科木通属落叶藤本植物，其果实又称木通子、八月扎、八月炸、预知子等，是一种集药用、食用于一身的野生经济植物，分布于我国南部、长江流域和西北地区[1-4]。八月瓜果实、叶、种子和根中富含糖、维生素、矿物质、有机酸、氨基酸、油脂、木质素、多酚、黄酮及抗衰老等成分[5-6]，可鲜食，也可酿酒、制醋、加工成果脯等食品[7-8]。民间多用于治疗小便赤涩、淋浊水肿、胸中烦热、喉痹咽痛、遍身拘痛、妇女经闭、乳汁不通等疾病[9-10]。

植物中一般存在大量的黄酮和酚类化合物，黄酮类化合物具有抗菌、消炎和抗氧化等功能[11-12]，酚类化合物具有改善心脑血管疾病，抗癌、抗氧化、防福射、抗病毒、抗肿瘤，调节人体氧化酶机制等功效[13-15]，因此黄酮和酚类两类化合物都具有重要的生理学保健功能。八月瓜可食部分为果肉，营养丰富，但八月瓜果皮约占整个果实质量的10%～15%，是八月瓜加工的主要副产物[16]，另外八月瓜种植期间大量的幼果需要摘除废弃，给环境造成一定污，若能从三叶木通果皮和叶中提取分析用途广泛的酚类成分和黄酮类化合物，不仅有效解决了三叶木通果皮废弃带来的环境污染问题，也为副产品的深层次加工提供依据，明显提高三叶木通的可利用途径和经济效益。

本文以贵州省野生八月瓜叶、果皮和果实为试验材料，对VC、总酚、总黄酮和9 种酚类成分含量进行测定，通过对总还原力（total reducing assay power，TRPA）、铁离子还原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）和ABTS+自由基清除能力的测定进行体外抗氧化能力评价，以期为合理开发利用八月瓜资源奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

八月瓜叶和果实采自贵州省遵义县沙湾镇八一村，经贵阳学院副教授杨碧仙鉴定为木通科木通属植物三叶木通 Akebia trifoliate（Thunb.）Koidz.的叶和果实，将八月瓜贮藏于4 ℃采样箱运回贵州省果品加工工程技术研究中心实验室，果肉和果皮分离，果肉去籽后，-80 ℃超低温冰箱保存备用。

没食子酸、儿茶素、绿原酸、表儿茶素、p-香豆酸、阿魏酸、鞣花酸、芦丁和槲皮素（9 种酚类分析标准品，纯度≥95.0%）、甲醇、三氟乙酸（色谱纯，纯度≥99.5%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；抗坏血酸、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）分析纯、福林酚（Folin-Ciocalteu）试剂：上海聚源生物科技有限公司；Trolox 试剂、三吡啶三吖嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐 [2，2-azinobis（3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]：美国 Sigma 公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

LC-20A 高效液相色谱仪、UV-2550 型紫外分光光度计：日本岛津公司；KQ5200DE 超声清洗器：昆山市超声仪器有限公司；IKA A11 研磨机：IKA 公司（德国）；C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：Waters 公司（中国上海）。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 酚类物质测定

1.3.1.1 供试品溶液的制备

称取10 g 样品研磨成浆，取2 g 果浆于10 mL 离心管中，加入4.0 mL 70%甲醇溶液，50 ℃超声波辅助提取30 min，冷却后10 000 r/min 离心15 min，将上清液过滤到10 mL 的容量瓶中，加入3.0 mL 70%甲醇溶液于残渣中再提取30 min，在4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，合并上清液，用70%甲醇溶液定容，用0.45 μm的滤膜过滤后待测，取1.0 mL 转移至进样瓶中等待进样，每个样品3 次重复。

1.3.1.2 酚类物质分析

准确称取9 种酚类物质标准品各10.00 mg，用甲醇溶解并定容至10.0 mL，配制成1.00 mg/mL 的酚类物质标准品贮备液，保存于-4 ℃冰箱备用。

C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），溶液 A（甲醇）和溶液 B（3 ‰ 三氟乙酸）：0～5 min，12 % A；5 min～10 min 12%～25%A；10 min～15 min，25% A；15 min～20 min，25%～30%A；20 min～25 min，30%A；25 min～35 min 30 %～35% A；35 min～40 min，35% A；40 min～50 min，35 %～50 % A；50 min～55 min，50 %～60 % A；55 min～60 min，60 % A。柱温：30 ℃；流动相速率：0.8 mL/min；进样量：10 μL；检测器：紫外检测器；波长：280 nm。

1.3.2 VC、总酚和总黄酮含量测定

VC含量测定采用比色法测定[17]，以100 g 鲜样品中抗坏血酸的质量（mg）表示，即mg AAE/100 g Fw；总酚含量测定采用福林酚比色法测定[18]，以每克鲜样品中没食子酸的质量（mg）表示，即mg GAE/g Fw；总黄酮含量测定参照丁建海等的方法[19]，以每克鲜样品中芦丁的质量（mg）表示，即 mg RE/g Fw。

1.3.3 抗氧化活性测定

抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）参照 Todorovic 等的方法[20]，以每克样品中Trolox的含量（mmoL）表示，即mmoL TE /g；总还原力（total reducing assay power，TRPA）参照 Oliveira 等的方法[21]，以每克样品中所含Trolox 的含量（mmoL）来表示，即mmoL TE/g；ABTS+自由基清除能力参照 Wootton-Beard 等的方法[22]，以每克样品中所含Trolox 的含量（mmoL）表示，即 mmol TE/g。

1.4 数据处理

试验数据用Excel 进行整理，测定结果用平均值±标准误差来表示。试验数据采用IBM SPSS 22.0 软件进行单因素差异分析（single factor difference analysis，ANOVA）和皮尔森（Pearson’s）相关性分析，使用GraphPad Prism 7.0 作图。

2 结果与分析

2.1 多酚标准品溶液和八月瓜样品高效液相（high performance liquid chromatography，HPLC）色谱图

多酚标准品溶液和八月瓜样品的HPLC 色谱图见图1。

图1 多酚标准品溶液和八月瓜样品的HPLC 色谱图Fig.1 The HPLC chromatograms of standard and leaves，peels and pulp of Akebia trifoliate

由图1看出，在1.3.1.2 色谱条件下，9 种多酚化合物的标准品得到了较好的分离（图1A），野生八月瓜叶、果皮和果肉样品溶液色谱图（图B、C、D）中的9 个目标峰，其保留时间与标准品溶液的9 个色谱峰保留时间一致。在此色谱条件下，八月瓜叶、果皮和果肉中的酚类成分得到较好的分离。

2.2 分光光度法测定八月瓜各指标的标准曲线方程

分光光度法测定八月瓜各指标的标准曲线方程、相关系数及选用波长见表1。

表1 回归方程Table 1 Regression equation

由表1可知，抗坏血酸、总酚、总黄酮、抗氧化能力（FRAP）、总还原力（TRPA）和 ABTS+自由基清除能力的回归方程均具有较好的线性相关性，相关系数R2的范围在 0.998 0～0.999 9。

2.3 八月瓜叶、果皮和果肉中活性成分分析

八月瓜叶、果皮和果肉中酚类成分含量见表2。

表2 八月瓜叶、果皮和果肉中酚类成分分析Table 2 Phenolic compositions analysis in the leaves，peels and pulp of Akebia trifoliate

由表2知，八月瓜叶、果皮和果肉中各成分含量差异显著（P＜0.05），各部位活性成分含量大小顺序为：叶＞果皮＞果肉，其中叶中没食子酸、儿茶素、p-香豆酸、阿魏酸、鞣花酸、芦丁、槲皮素、抗坏血酸和总酚含量相对较高，其中没食子酸含量 （[715.64±4.69）μg/g Fw]是果皮、果肉的6 倍和12 倍；儿茶素含量（[9.16±0.41）μg/g Fw]是果皮、果肉的 3 倍和 17 倍；p-香豆酸含量（[0.6±0.06）μg/g Fw]是果皮的7.5 倍，果肉中未检测到；阿魏酸含量（[7.88±0.43）μg/g Fw]是果皮、果肉的1.3 倍和88 倍；鞣花酸含量（[147.61±0.87）μg/g Fw]是果皮、果肉的12 倍和9 倍；芦丁在叶中含量（[50.24±1.53）μg/g Fw]是果皮和果肉的10 倍，芦丁在果肉和果皮中的含量差异不显著（P＞0.05）；槲皮素含量（[27.36±0.77）μg/g Fw]是果皮、果肉的 6 倍和 9 倍；抗坏血酸含量（[200.12±0.23）mg/100 g FW]是果皮、果肉的7 倍和81 倍；总酚（[3.44±0.11）mg/g FW]含量是果皮、果肉的1.3 倍和43 倍。而果皮中绿原酸和表儿茶素含量相对较高，其中绿原酸含量（[52.82±0.71）μg/g Fw]是叶、果肉1.2 倍和123 倍；表儿茶素含量 （[1.08±0.10）μg/g Fw]是叶、果肉3 倍和18 倍。八月瓜叶和果皮中总黄酮含量差异不显著（P＞0.05），叶和果皮中总黄酮含量是果肉（[0.19±0.00）μg/g Fw]的24 倍。综上所述，八月瓜除了可食用部分果肉，其叶和茎均含有较高的活性物质且不同部位间存在显著差异。

2.4 八月瓜叶、果皮和果肉中抗氧化活性分析

八月瓜叶、果皮和果肉的抗氧化能力见图2。

图2 八月瓜叶、果皮和果肉的抗氧化能力分析Fig.2 Antioxidant activity analysis in Akebia trifoliate of leaves，peels and pulp

由图2可知，八月瓜各部位提取物抗氧化活性差异较大，叶和果皮的抗氧化活性显著高于果肉（P＜0.05），随着质量浓度增加，八月瓜叶、果皮和果肉抗氧化能力、总还原力和ABTS+自由基清除能力均呈显著增加趋势，且叶的抗氧化活性与果皮的差距变大，叶的ABTS+自由基清除能力是果皮的2 倍是果肉的3 倍。

回归分析结果显示，八月瓜叶、果皮和果肉对FRAP、ABTS+自由基清除能力和TRPA 均有较好的抗氧化活性，八月瓜叶质量浓度与TRPA 的相关方程为：y=0.136x+0.537 5，相关系数R2=0.985 5，果皮质量浓度与TRPA 的相关方程为：y=0.128 3x+0.281 2，相关系数R2=0.990 7，果肉质量浓度与TRPA 的相关方程为：y=0.012 1x+0.030 3，相关系数R2=0.991 4；八月瓜叶质量浓度与FRAP 的相关方程为：y=0.788 7x+1.013 5，相关系数R2=0.984 7，果皮质量浓度与FRAP 的相关方程为：y=0.441 3x+1.246 6，相关系数R2=0.991 2，果肉质量浓度与FRAP 的相关方程为：y=0.037 7x+0.042 3，相关系数R2=0.983 3；八月瓜叶质量浓度与ABTS+自由基清除能力的相关方程为：y=14.568x+12.409，相关系数R2=0.990 7，果皮质量浓度与ABTS+自由基清除能力的相关方程为：y=11.673x+2.441 2，相关系数 R2=0.981 3，果肉质量浓度与ABTS+自由基清除能力的相关方程为：y=3.985x+2.431 1，相关系数 R2=0.981 8。

2.5 酚类物质及抗氧化活性的相关性分析

八月瓜叶、果皮和果肉的各项指标进行相关性分析结果如表3所示。

表3 八月瓜中各项指标的相关性分析Table 3 Correlation coefficients of different indices

总酚与绿原酸、阿魏酸呈极显著正相关（r 分别为0.922 和 0.999），与儿茶素呈显著正相关（r 为 0.880）；总黄酮与绿原酸、阿魏酸和总酚呈极显著正相关（r 分别为 0.988、0.965 和 0.970）；TRPA 与儿茶素、阿魏酸、总酚和总黄酮呈极显著正相关（r 分别为0.927、0.989、0.990 和0.931），与没食子酸、绿原酸、p-香豆酸和抗坏血酸呈显著正相关 （r 分别为 0.826、0.869、0.835 和0.844）；FRAP 与阿魏酸、总酚、总黄酮和 TRPA 呈极显著正相关（r 分别为 0.997、0.999、0.965 和 0.989），与儿茶素、绿原酸呈显著正相关（r 分别为0.886 和0.913）；ABTS+自由基清除能力与儿茶素、p-香豆酸、阿魏酸、抗坏血酸、总酚、TRPA 和FRAP 呈极显著正相关（r 分别为 0.962、0.891、0.965、0.901、0.966、0.990 和 0.970），与没食子酸、鞣花酸、芦丁、槲皮素和总黄酮呈显著正相关（r 分别为 0.887、0.830、0.839、0.872 和 0.880）。

3 结论与讨论

邵显会[23]分析了三叶木通不同部位总黄酮含量，发现黄酮含量从高到低依次是根（5.72%）＞叶（4.5%）＞果皮（2.0%）＞果肉（0.2%），张孟琴等[24]分析了三叶木通果皮黄酮含量（2.32%），本研究发现不同部位黄酮含量的总体趋势和邵显会等研究一致，但含量显著低于邵显会和张孟琴等报道，且总黄酮在果皮和叶中含量差异不显著；欧阳玉祝等[25]用离子沉淀法分离了果皮中总多酚，总多酚提取率为5.103 7%，顾仁勇等[26]响应面优化超临界CO2萃取八月瓜幼果多酚，八月瓜幼果多酚萃取得率可达6.41%，本研究发现八月瓜不同部位多酚含量的总体趋势与陆俊等[27]的研究一致，但含量显著低于文献报道，本次试验八月瓜不同部位黄酮和总酚含量低于文献报道的主要原因在于鲜样、干样中水分含量的不同、采样地不同和提取方法的差异。Li L等[28]报道三叶木通鲜果肉中VC含量108 mg/100 g，白木通鲜果中VC含量930 mg/100 g，本研究发现八月瓜鲜果中VC含量2.47 mg/100 g，与文献报道相差较大，主要原因在于果实的成熟度不同、品种不同和提取方法的差异；本试验中八月瓜果皮和叶中的VC含量未曾报道。近年来，前人对八月瓜酚类化合物的研究主要侧重于总酚测定和一些新的酚醇类化合物的分离及药用机制的研究[29-30]，但未研究八月瓜各部位中具体酚类成分含量及抗氧化活性，本研究发现八月瓜叶、果皮和果肉中酚类成分含量差异显著（P＜0.05），主要酚类成分依次为没食子酸、儿茶素、绿原酸、阿魏酸、鞣花酸、芦丁和槲皮素，且各化合物在叶中含量最高，而绿原酸和表儿茶素在果皮中含量相对最高，果肉中各化合物含量相对低，p-香豆酸和芦丁在八月瓜果肉和果皮中的含量差异不显著（P＞0.05）；八月瓜叶、果皮均有较强的FRAP、TRPA 和ABTS+自由基清除能力，叶、果皮和果肉抗氧化活性随质量浓度的增加呈正相关增长，叶和果皮的抗氧化活性显著高于果肉，FRAP 和ABTS+自由基清除能力依次为叶＞果皮＞果肉，其中叶TRPA 含量是果皮、果肉的 1.5 倍和 15 倍，叶 FRAP 含量是果皮、果肉的1.4 倍和28.5 倍，叶ABTS+自由基清除能力是果皮、果肉的1.5 倍和2.8 倍，这与陆俊等[27]研究结果趋势一致，但叶、果皮和果肉中FRAP 和ABTS+自由基清除能力与陆俊等测定结果相差较大；抗氧化活性（TRPA、FRAP、ABTS+自由基清除能力）与化学成分之间的相关性显示，不同成分对抗氧化活性的贡献并不相同，TRPA 与儿茶素、阿魏酸、总酚和总黄酮呈极显著正相关，与没食子酸、绿原酸、p-香豆酸和抗坏血酸呈显著正相关；FRAP 与阿魏酸、总酚和总黄酮呈极显著正相关，与儿茶素、绿原酸呈显著正相关；ABTS+自由基清除能力与儿茶素、p-香豆酸、阿魏酸、抗坏血酸和总酚呈极显著正相关，与没食子酸、鞣花酸、芦丁、槲皮素和总黄酮呈显著正相关。此外，抗氧化活性之间也显示出显著的相关性，表明抗氧化活性测定都是可靠和可互换的；黄酮和多酚含量之间也存在强相关，和金银萍等[31]对五味子抗氧化能力与酚酸、总黄酮相关性研究中的结论一致。本研究发现VC、黄酮含量、总酚含量和个别酚类成分与抗氧化能力间有显著相关性，因此八月瓜不同部位的抗氧化能力不一，且叶和果皮的抗氧化能力显著高于果肉，可考虑作为天然抗氧化剂，用于美容护肤品、植物酚类保健品或者防止心脑血管疾病药物的开发。

综上分析，八月瓜叶、果皮、果肉中均含有活性物质含量和抗氧化能力，且差异显著，得出：酚类成分主要为没食子酸、儿茶素、绿原酸、阿魏酸、鞣花酸、芦丁和槲皮素，八月瓜叶和果皮有较强的FRAP、TRPA 和ABTS+自由基清除能力，叶和果皮抗氧化活性显著高于果肉。相关性分析得到儿茶素、阿魏酸和总酚对TRPA 的测定值贡献最强，阿魏酸、总酚和总黄酮对FRAP 的测定值贡献最强，儿茶素、p-香豆酸、阿魏酸、抗坏血酸和总酚对ABTS+自由基清除能力的贡献最强。各部位的抗氧化能力大小与VC、黄酮类、多酚和相应酚类成分含量呈强相关关系。试验研究结果说明八月瓜由于不同部位化合物存在较大差异，对其开发利用时应充分考虑各自优势，除可食用部分果肉外，合理利用八月瓜果皮和叶，解决果农废弃物处理难题，变废为宝，对促进八月瓜深加工产业的健康发展有深远的意义。