茶多酚对力竭运动大鼠骨骼肌组织中细胞凋亡的影响

张沙骆 王丹 王芳

(长沙民政职业技术学院医学院，湖南 长沙 410004)

现代竞技体育活动中，运动疲劳是一种常见现象，运动疲劳不仅严重影响机体运动的能力，严重者甚至会危害机体健康〔1〕。运动疲劳的发生与骨骼肌细胞凋亡、氧化损伤等有关，寻找有效的方法降低骨骼肌细胞凋亡水平、提高运动能力是目前研究的重点〔2,3〕。茶多酚以儿茶素类为主体，是一种多酚类物质，其具有抗衰老、预防肥胖、抗辐射等作用〔4〕。目前的研究显示，茶多酚具有改善运动大鼠运动功能的作用，而对于其在骨骼肌细胞凋亡及对运动训练后力竭运动大鼠运动能力的作用尚不明确〔5,6〕。本实验主要探讨茶多酚对力竭运动大鼠骨骼肌细胞凋亡、运动能力等的影响，以期为缓解运动疲劳提供新思路。

1 材料与方法

1.1材料 3月龄SD雄性大鼠购自中南大学实验动物中心，体重230～250 g，自由饮水，温度20～24℃，湿度为40～55%，每天光照时间为12 h。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性检测试剂盒购自美国Sigma-Aldrich；超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒购自美国Biovision；过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒购自上海榕柏生物技术有限公司；丙二醛(MDA)含量检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；羰基化蛋白含量检测试剂盒购自美国Cayman；活化型Caspase-3(酶切Caspase-3)抗体购自美国Cell Signaling Technology；乳酸含量检测试剂盒、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自瑞士Roche。

1.2实验分组及运动方法 SD大鼠分成4组，分别为安静组、训练组、茶多酚安静组、茶多酚训练组，每组10只。实验开始前5 d，训练组和茶多酚训练组进行5 d的适应性的跑台训练(第1天，15 m/min，20 min；第2天，15 m/min，25 min；第3天，20 m/min，25 min；第4天，20 m/min，30 min；第5天，25 m/min，30 min)，适应性训练结束以后，按照25 m/min，30 min方式正式开始跑台运动训练，计为实验1 d，每周训练5 d，其中星期一和星期二休息，连续训练4 w。茶多酚训练组和茶多酚安静组在运动训练的前1 h，给予280 mg/kg的茶多酚灌胃处理。训练组和茶多酚训练组在最后1次运动训练至力竭，力竭运动标准为：大鼠不能维持跑台设置的速度，大鼠随着皮带进入到跑台后端的挡板处，经电刺激和毛刷驱赶均无效。记录各组大鼠到达力竭的运动时间。安静组、训练组给予等量的生理盐水灌胃。安静组、茶多酚安静组不运动训练，只给予最后1次的力竭运动。

1.3组织和血液标本采集 各组大鼠力竭运动结束后，用乙醚将各组大鼠麻醉以后，断颈，取5 ml血液，静置30 min以后，3 000 r/min离心10 min，吸取上清溶液，保存在-20℃。同时取各组大鼠左右肢相同位置的腓肠肌，用冰预冷的生理盐水洗涤以后，取一部分组织制作组织匀浆，剩余组织用于Western印迹、TUNEL法检测。

1.4比色法检测血乳酸含量 取1.3中的血清，用比色法检测血清中乳酸含量，步骤同试剂盒说明书，乳酸含量=(测定管的OD值-空白管的OD值)/(标准管的OD值-空白管的OD值)×标准浓度÷待测样本浓度

1.5TUNEL法测定细胞凋亡 取1.3中大鼠骨骼肌组织，常规方法制作组织石蜡切片，用二甲苯浸泡2次以后，浓度梯度酒精中浸泡，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，加入Proteinase K工作液，孵育20 min，添加细胞通透液孵育8 min，经PBS洗涤，添加TUNEL染色液，在暗湿盒中孵育60 min。PBS洗涤以后，添加50 μl的Converter-POD，继续反应30 min，滴加二氨基联苯胺(DAB)底物，在室温中孵育10 min后，经PBS洗涤，苏木素染色，光学显微镜下观察细胞凋亡情况，每个切片观察500个细胞，计算每100个细胞中凋亡细胞数量，即为细胞凋亡率。

1.6Western印迹法检测细胞中酶切Caspase-3蛋白水平 取1.3中大鼠骨骼肌组织，剪碎后，添加裂解液，超声破碎以后，充分裂解，置于4℃离心机，12 000 r/min离心10 min，取蛋白上清，保存在-80℃。按照聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量检测试剂盒对蛋白定量。将蛋白变性(蛋白样品和5倍上样缓冲液按照体积比为4∶1混匀煮沸5 min)处理，以每个泳道中加入30 μg蛋白样品进行电泳，电泳电压为90 V恒压，观察溴酚蓝染料进入底部后，将电源关闭。取出凝胶，在90 V电压条件下、冰浴将蛋白转移到NC膜上。用5% 牛血清白蛋白将NC膜在37℃孵育1.5 h封闭后，同一抗结合(1∶800稀释，4℃过夜)、二抗结合(1∶2 000比例稀释，37℃孵育1.5 h)后，用ECL法显色。GAPDH作为参照，分析酶切Caspase-3蛋白水平。

1.7骨骼肌组织中抗氧化酶GSH-PX、SOD、CAT活性和羰基化蛋白、MDA含量检测 取1.3中大鼠骨骼肌组织匀浆液，检测组织匀浆液中GSH-PX活性(比色法)、SOD活性(黄嘌呤氧化酶法)、CAT活性(钼酸铵比色法)和羰基化蛋白含量(比色法)、MDA含量(硫代巴比妥酸法)，步骤均同试剂盒说明书标准流程。

1.8统计学方法 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析及SNK-q检验。

2 结 果

2.1茶多酚可明显改善力竭运动大鼠运动能力 表1可见，训练组、茶多酚安静组、茶多酚训练组力竭运动时间明显高于安静组，并且血乳酸值均明显低于安静组(均P<0.05)。茶多酚训练组力竭运动时间明显高于茶多酚安静组和训练组，血乳酸值均明显低于茶多酚安静组和训练组(均P<0.05)。运动训练联合茶多酚可以明显提高大鼠的运动能力。

表1 各组大鼠力竭运动时间和血乳酸含量比较

与安静组比较:1)P<0.05；与茶多酚训练组比较:2)P<0.05，下表同

2.2茶多酚可明显降低力竭运动大鼠骨骼肌组织中细胞凋亡和酶切Caspase-3蛋白表达水平 图1和表2所示，训练组、茶多酚安静组、茶多酚训练组大鼠骨骼肌组织中细胞凋亡水平明显低于安静组，酶切Caspase-3蛋白水平也明显低于安静组(均P<0.05)。茶多酚训练组骨骼肌组织中细胞凋亡水平明显低于茶多酚安静组和训练组，酶切Caspase-3蛋白水平也明显低于茶多酚安静组和训练组(均P<0.05)。运动训练联合茶多酚可以明显减少力竭运动大鼠骨骼肌细胞凋亡。

1～4：安静组、训练组、茶多酚安静组、茶多酚训练组图1 Western印迹检测大鼠骨骼肌组织中酶切Caspase-3蛋白水平

2.3茶多酚可明显提高力竭运动大鼠骨骼肌组织中抗氧化酶GSH-PX、SOD、CAT活性 表3所示，训练组、茶多酚安静组、茶多酚训练组大鼠骨骼肌组织中抗氧化酶GSH-PX、SOD、CAT活性明显高于安静组(均P<0.05)。茶多酚训练组骨骼肌组织中抗氧化酶GSH-PX、SOD、CAT活性明显高于茶多酚安静组和训练组。运动训练联合茶多酚可以明显提高力竭运动大鼠骨骼肌组织的抗氧化能力。

组别SOD(U/mg)CAT(U/mg)GSH-PX(U/mg)羰基化蛋白(nmol/mg)MDA(nmol/mg)安静组81.58±8.565.47±0.57170.46±13.2712.56±1.1622.14±2.63训练组108.89±10.581)2)7.52±0.821)2)206.36±11.021)2)8.89±0.961)2)14.75±1.321)2)茶多酚安静组104.25±9.521)2)6.58±0.411)2)197.02±11.351)2)9.95±1.101)2)16.24±1.451)2)茶多酚训练组131.54±11.481)9.66±1.011)241.63±13.581)7.02±0.851)12.01±1.201)F/P值41.173/0.00057.867/0.00056.653/0.00050.939/0.00060.007/0.000

2.4茶多酚可明显减轻力竭运动大鼠骨骼肌组织的氧化损伤 表3所示，训练组、茶多酚安静组、茶多酚训练组大鼠骨骼肌组织中羰基化蛋白和MDA含量明显低于安静组，差异有统计学意义(均P<0.05)。茶多酚训练组骨骼肌组织中羰基化蛋白和MDA含量明显低于茶多酚安静组和训练组(均P<0.05)。运动训练联合茶多酚可以减轻力竭运动大鼠骨骼肌组织氧化损伤。

3 讨 论

茶多酚具有多种药理学作用和生物学活性，其具有显著的抗氧化、抗疲劳等作用，研究报道显示，茶多酚具有改善机体运动能力的功效，其一方面可以提高机体对抗运动疲劳的能力，另外，茶多酚还具有提高运动大鼠抗氧化酶活性的作用〔7〕。力竭运动时间的长短是衡量生命体抗疲劳能力、运动能力的重要指标，力竭时间越长，机体运动能力也就越强〔8〕。骨骼肌是运动过程中乳酸产生的主要部位，其过度积累能够诱导内环境稳态失衡，运动过程中血液乳酸含量变化是乳酸清除和乳酸生成的平衡结果，其水平的高低与机体的运动能力有关〔9,10〕。本实验结果表明，茶多酚不仅具有提高大鼠运动能力的作用，还能够提高运动训练大鼠运动能力。

骨骼肌细胞凋亡与运动疲劳的发生密切相关，运动疲劳的发生往往伴随着机体抗氧化能力的降低，而机体抗氧化能力的降低与组织中抗氧化酶活性、氧自由基的过多聚集有关，过量的氧自由基可以诱发Caspase凋亡反应，促进细胞凋亡的发生〔11～13〕。Caspase-3是Caspase凋亡反应下游的执行因子，其活化后标志着细胞凋亡进入不可逆的阶段〔14〕。MDA是脂质发生过氧化的产物，其表达水平升高是组织氧化损伤的标志，GSH-PX、SOD、CAT是机体内重要的抗氧化酶，其活性的高低与机体内氧化平衡状态的维持具有密切关系〔15～18〕。羰基化蛋白是机体中的蛋白质受到脂质过氧化等作用产生的活性羰基类物质，羰基化修饰的蛋白质表达水平升高标志着组织氧化损伤的发生〔19〕。茶多酚具有抗氧化作用，其可以提高大鼠抗氧化能力〔20〕。

本实验的结果显示，茶多酚可能通过减轻力竭运动大鼠氧化损伤减少骨骼肌组织细胞凋亡，实验结果还发现，茶多酚还能够协同运动训练提高力竭运动大鼠骨骼肌组织抗氧化能力，进一步减少骨骼肌细胞凋亡发生，说明茶多酚不仅可以通过抗氧化损伤抑制骨骼肌细胞凋亡发生，还可以协同运动训练减少力竭运动大鼠损伤。

总而言之，茶多酚能够增加大鼠运动能力，茶多酚通过增加力竭运动大鼠抗氧化能力减少骨骼肌细胞凋亡，另外，茶多酚还能够协同运动训练改善大鼠的运动能力，这为提高机体的运动能力提供了新方向。本研究只选用了一种浓度的茶多酚处理力竭运动大鼠，后续会探讨不同浓度的茶多酚在力竭运动大鼠中的作用，为茶多酚提高机体运动能力的临床应用提供依据。