松果菊苷对衰老大鼠生精细胞胰岛素通路IRS1、IGF-1、IGFBP3基因表达的影响

甄晓兰 崔晓燕 刘雪莉 牛嗣云

(1河北省药品检验研究院，河北 石家庄 050051；2河北大学医学院)

随着年龄的增长，人体的细胞、组织、器官在结构和功能上逐渐退化。睾丸作为男性生殖系统的重要器官，睾丸功能的减退是衰老的早期信号之一。男性衰老导致的睾丸功能衰退，精子质量下降，甚至产生性功能障碍。近年来研究发现中药在延缓衰老过程中发挥重要作用〔1〕。松果菊苷是肉苁蓉的主要生物活性成分，通过保护精子和增加精子的产量提高男性的性功能〔2〕。本文旨在探讨松果菊苷对大鼠生精细胞中胰岛素通路胰岛素受体底物(IRS)1、胰岛素样生长因子(IGF)-1、IGF结合蛋白(IGFBP)3基因表达的影响。

1 材料和方法

1.1生精细胞的培养和鉴定 ①支持细胞：取17～21 d的Wistar大鼠，深度麻醉至死，取出双侧睾丸置于预冷的 D-Hanks液中，使用Ⅳ型胶原酶和胰蛋白酶消化使精曲小管断裂，将支持细胞培养在含 10%胎牛血清(FBS)的 DMEM/F12 的培养液中，培养箱中培养4 h，转移上清液至另一新的培养瓶中，继续培养3 d。②精原干细胞：取7～9 d的Wistar大鼠睾丸组织，深度麻醉至死，取出双侧睾丸置于预冷的 D-Hanks液中，采用两步酶消化法和差异贴壁法分离纯化精原干细胞，置于 34 ℃ 培养箱中培养3 h，转移上清液至另一离心管中计数，(5～7)×105/ml接种到支持细胞上，继续培养7d〔3〕。

1.2细胞衰老模型建立和鉴定 将分离培养的精原干细胞，置于含15%FBS的DMEM/F12培养液中，与支持细胞共培养7 d，采用自由基氧化损伤方法，加入浓度为 50 μmol/L H2O2和 100 μmol/L硫酸亚铁(FeSO4)，连续干预8 h，更换新鲜培养液，继续培养72 h，β-半乳糖甘酶染色鉴定。

1.3细胞分组 根据实验目的将生精细胞分为3组：正常组(NG)，将培养至7 d的生精细胞，继续培养72 h；衰老模型组(AG)，将生精细胞培养至7 d,加入终浓度为 50 μmol/L的H2O2和 100 μmol/L FeSO4，连续干预8 h，换液，继续培养至72 h；松果菊苷组(SGJG)，将生精细胞培养至7 d，加入终浓度分别为 50 μmol/L的H2O2和 100 μmol/L FeSO4，连续干预8 h，换液，加入终浓度为20 μmol/L的松果菊苷，继续培养72 h。

1.4实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR) Trizol 法提取生精细胞总核糖核酸(RNA)，逆转录反应将总RNA反转录到补脱氧核糖核酸(cDNA)，以反转录后的单链 cDNA 为模板，使用SYBR荧光染料，高效PCR酶进行qRT-PCR扩增，用β-actin作内参。利用2-ΔΔct分析方法并结合 SPSS19.0 软件对qRT-PCR扩增结果进行统计学分析。引物序列见表1。

表1 引物序列和各个基因的退火温度

1.5免疫荧光技术 多聚甲醛固定细胞爬片30 min，用0.5%Triton X-100透化20 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤。与5%血清白蛋白在室温孵育20 min，封闭非特异性位点，一抗孵育4℃过夜。次日PBS洗涤并在37 ℃条件下与二抗孵育1 h后，PBS洗涤。在室温下与4'-6'-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)孵育20 min，用PBS洗涤，室温晾干，50%甘油封片。荧光显微镜下观察，随机选取10个视野，每个视野求得平均光密度。每组实验重复3次。

1.6Western印迹 用裂解缓冲液裂解细胞蛋白，使用牛血清白蛋白(BSA)测定算蛋白质浓度。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰凝胶电泳(SDS-PAGE)分离80 μg蛋白质裂解物并转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。脱脂奶粉室温封闭1 h后，一抗孵育4℃过夜。次日，二抗室温孵育2 h，PBS-吐温(T)洗涤，显影。实验重复3次，所得图像采用Image J软件记录各个蛋白的ID值(灰度值)，β-actin为内参，目的蛋白的相对表达量=目的蛋白的ID值/β-actin ID值。

1.7统计分析 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验、Dunnettt检验。

2 结 果

2.1松果菊苷对生精细胞 IRS1、IGF1、IGFBP3 蛋白表达的影响 荧光染色细胞核用DAPI 染色呈蓝色，IRS1、IRS2、IGFBP3阳性产物发红色荧光，阳性产物定位于细胞质，见图1。

图1 生精细胞中IRS1，IGF1和IGFBP3的平均光密度

AG IRS1，IGF1的平均光密度明显低于NG，IGFBP3阳性率明显高于NG。SGJG组IRS1、IGF1的平均光密度明显高于AG，IGFBP3 平均光密度明显低于AG。见表2。IRS1，IGF1和IGFBP3的蛋白表达趋势与免疫荧光染色一致，见图2、表3。

表2 生精细胞中IRS1、IGF1和IGFBP3免疫荧光平均光密度

与NG比较：1)P<0.05；与AG比较：2)P<0.05；下表同

图2 IRS1、IGF1和IGFBP3蛋白在生精细胞中的表达水平

组别IRS1IGF1IGFBP3NG0.95±0.020.83±0.040.96±0.04AG0.57±0.041)0.44±0.031)1.28±0.031)SGJG0.73±0.042)0.61±0.032)0.92±0.012)F值918.64107.12151.13P值<0.001<0.001<0.001

2.2松果菊苷对生精细胞 IRS1、IGF1、IGFBP3 mRNA 表达水平的影响 AG IRS1，IGF1mRNA表达水平明显低于NG，IGFBP3 mRNA表达水平明显高于NG。SGJG IRS1，IGF1 mRNA表达水平明显高于AG，IGFBP3 mRNA表达水平明显低于AG，见表4。

表4 生精细胞中IRS1、IGF1和IGFBP3mRNA的表达水平

2.3各组生精细胞 IGF1/IGFBP3 比值的变化 IGF1/IGFBP3 比值增加可减少抑制生精细胞的凋亡率。AG IGF1/IGFBP3比值与NG的比较，在mRNA和蛋白表达水平均明显下降；SGJG与AG比较，IGF1/IGFBP3比值显著升高，表明松果菊苷可通过调节IGF-1/IGFBP3 比值抑制生精细胞的凋亡。见表5。

表5 生精细胞中IGF1/IGFBP3 比值

3 讨 论

研究证明老年男性血睾屏障出现异常，支持细胞数量减少，打破生精细胞生成和凋亡的动态平衡，导致精子减少，甚至生殖功能的衰退〔4，5〕。IGF1 作为一种特异性神经营养因子，可促进有丝分裂，调节着细胞生长、增殖和分化，这种多效性作用对生殖至关重要〔6〕。IGF1 与多种性激素和细胞因子相互作用调节间质细胞增殖和分化，促进睾酮合成并调节精子产生〔7〕。IRS是IGF1 受体和酪氨酸激酶的底物〔8〕。胰岛素受体底物蛋白IRS1是胰岛素受体酪氨酸激酶的关键靶标，参与代谢的激素控制〔9〕。IGFBP3是IGF1的结合蛋白，IGFBP3与IGF1 结合并抑制其活性，进一步抑制周边细胞的生长和有丝分裂及抗凋亡的生物学功能〔10，11〕。IGFBP3-IGF1的结合力明显要高于IGF1R-IGF1的亲和力，IGFBP3-IGF1一旦结合将抑制IGF1与IGF1R的结合，阻断IGF1对细胞的生物学效应。IRS1、IGF1、IGFBP3是胰岛素信号通路的关键基因，该结果表明胰岛素信号通路在生精细胞衰老中具有重要作用。松果菊苷通过提高生精细胞 IRS1、IGF1 mRNA 和蛋白表达，抑制IGFBP3 mRNA和蛋白表达，提高IGF-1/IGFBP3 比值，从而改变生精细胞的衰老状态。