TGF-β1通过抑制小胶质细胞活化对帕金森病大鼠神经保护作用及机制

郭建新 孙学平 李平 皇甫赟 张风娟

(河南医学高等专科学校 1医学系，河南 郑州 451191；2附属医院神经内科)

帕金森疾病(PD)属于慢性进展神经疾病，65～70岁发病率为1%，80岁以上发病率增加3%，严重影响老年患者生活质量〔1〕。目前治疗PD主要采用多巴胺替代治疗，临床效果好，可明显改善患者临床症状，但长期使用会产生较多副作用，且目前还未找到药物能够逆转PD的发生，因此探究PD的发生发展机制对于PD的预防、治疗具有一定的积极意义〔2〕。转化生长因子(TGF)-β1是一种具有免疫抑制和抗炎作用的多效性细胞因子，文献报道TGF-β1信号系统激活后对中枢神经系统具有保护作用，可抑制小胶质细胞活化〔3〕。Liu等〔4〕研究显示，经外源给予TGF-β1预处理对PD大鼠神经具有一定的保护作用，然而其具体作用机制目前尚不明确。本研究拟分析TGF-β1治疗对PD大鼠神经的保护作用。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF清洁级SD大鼠，8周龄，体重200～230 g，购于河南省医药科学研究院，许可证号：SYXK(豫)2016-0008，均在统一环境喂养，光照、黑暗交替12 h，自由饮水摄食，饲养温度23～25℃，相对湿度为50%～70%。正常喂养1 w后进行模型制备。

1.2试剂与仪器 6-羟基多巴胺(OHDA)、脂多糖(LPS)、阿普吗啡购于美国Simga公司；TGF-β1购于美国R&D公司；肿瘤坏死因子(TNF)-α,一氧化氮合酶(iNOS)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒购于北京中杉金桥公司;兔抗鼠络氨酸羟化酶(TH)单克隆抗体购于美国CST公司；CD11b单抗购于美国SANTA公司；蛋白提取试剂盒购于日本Takara公司；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)检测试剂盒购于Sigma公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)垂直电泳仪、蛋白凝胶成像仪均购于美国Bio-rad公司；荧光显微镜购于日本OLYMPUS公司。紫外分光光度仪购于Thermo scientific公司。

1.3PD动物模型制备〔5〕大鼠腹腔注射400 mg/kg 10%水合氯醛，取仰卧位，固定于立体定位仪中，参照《大鼠立体定位图谱》选取右侧脑部黑质坐标，A点：硬膜下7.6 mm，中缝右2.4 mm，前卤后方5.0 mm，B点：中缝右侧1.6 mm，前卤后方5.6 mm，硬膜下7.8 mm，采用微量注射器在A、B两点均注射4 μg/μl 6-OHDA 3 μl，注射速率1 μl/min，结束后留针10 min进行拔针。模型鉴定：腹腔注射0.5 mg/ml阿普吗啡，10 min后观察大鼠逆时针旋转次数，共观察30 min，旋转次数≥210次为模型制备成功。共64只大鼠模型制备成功。

1.4动物给药与分组 将大鼠分为对照(Control)组、PD组、TGF-β1 25 ng/μl组、TGF-β1 50 ng/μl组、TGF-β1 100 ng/μl组各12只。PD组：模型鉴定后经右侧纹状体内离体定向注射等量生理盐水。TGF-β1 治疗组：经右侧纹状体内离体定向注射25、50、100 ng/μl TGF-β1 5 μl。1次/d，连续注射1 w。

1.5大鼠行为学评估 观察大鼠行为改变，并进行阿扑吗啡(APO)旋转诱导实验，统计用药后30 min内大鼠旋转圈数，计算平均旋转圈数。

1.6标本采集 各组随机选取10只大鼠，腹腔注射10%戊巴比妥钠后固定于试验台，断头取脑，将大鼠脑组织置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，进行石蜡包埋制备脑组织石蜡切片4 μm。各组随机选取6只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，打开腹腔采集腹主动脉血3 ml，3 000 r/min离心15 min，保存上层血清。

1.7免疫组化检测脑组织黑质中TH、CD11b表达 石蜡切片脱蜡、脱水、抗原热修复后，添加3%过氧化氢溶液消除内源性过氧化物酶活，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后，滴加山羊血清封闭，添加TH、CD11b一抗置于4℃冰箱中进行过夜，清洗后添加二抗，PBS溶液清洗后添加辣根过氧化物酶(HRP)标记卵酶链白素，加入二氨基联苯胺(DAB)显色液进行显色反应，蒸馏水清洗后，苏木素复染，随后在乙醇中脱水，滴加二甲苯进行透明处理，用中性树脂进行封片，置于显微镜下进行观察。每张切片挑选10个黑质部清晰视野，计算阳性染色细胞数比例。

1.8ELISA法检测T淋巴细胞TNF-α、iNOS水平 按照ELISA试剂盒检测大鼠血清中TNF-α、iNOS水平。

1.9蛋白免疫印迹(WB) 取出保存组织，添加放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液，提取组织总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，SDS-PAGE垂直电泳分离目的蛋白，结束后将蛋白凝胶转移到聚偏氟乙烯(PDVF)膜上,5%脱脂牛奶封闭后添加人白细胞抗原(HLA)-G、β-actin一抗(稀释倍数1∶500)4℃孵育过夜，添加HRP标记IgG二抗(稀释倍数：1∶5 000)室温下孵育1 h，以β-actin蛋白表达作为内参，采用Image软件评估蛋白表达。

1.10大鼠小胶质细胞培养与活化 参考文献法培养小胶质细胞〔6〕：出生1 d乳鼠处死后获取大脑皮层，将海马、血管等去除后，剪碎，加入0.25%胰酶溶液消化后添加胎牛血清(FBS)终止消化，滤膜过滤后离心，添加完全培养液，连续培养14 d后振荡培养2 h，收集脱落上清细胞为小胶质细胞。经流式细胞仪检测小胶质细胞纯度比例均达95%以上，符合后续实验要求。取初代细胞继续培养7 d后添加10 mg/L LPS刺激活化小胶质细胞，随后添加2、5、10 ng/μl TGF-β1同时设置空白组，分为空白组、LPS组、TGF-β1 2 ng/μl组、TGF-β1 5 ng/μl组、TGF-β1 10 ng/μl组。

1.11小胶质细胞活性检测 各组细胞继续培养24 h后，加入噻唑蓝(MTT)孵育4 h，舍弃上清液，添加二甲基亚砜(DMSO)溶液，震荡后在490 nm下测定细胞培养孔内OD值。以未进行处理的细胞作为对照组，细胞活性抑制率=(实验组OD-空白组OD)/空白组OD×100%。

1.12免疫荧光检测小胶质细胞形态 各组细胞继续培养24 h，将细胞用CD11b荧光抗体标记，在荧光显微镜下检测细胞形态变化。

1.13细胞CD11b、TGF-β1、Smad3蛋白表达水平 收集培养后细胞，采用WB法检测细胞CD11b、TGF-β1、Smad3蛋白表达。

1.14统计学方法 采用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1大鼠行为学评估 在模型制备过程中未出现大鼠死亡，PD组大鼠表现为行动迟缓、活动量少、躬身、竖毛等，TGF-β1各组大鼠活动量有所增加，行动正常，竖毛较少，随着处理剂量的增加，大鼠恢复较好。与Control组〔(6.24±0.03)圈/min〕相比，PD组APO诱导圈数〔(10.82±0.49)圈/min〕显著升高(P<0.05)；与PD组相比，TGF-β1 25、50、100 ng/μl组〔(9.44±0.65)、(8.26±0.51)、(7.03±0.62)圈/min〕显著降低(P<0.05)。

2.2各组血清中TNF-α、iNOS水平比较 与 Control组相比，PD组血清中TNF-α、iNOS水平显著升高(P<0.05)；与PD组相比，TGF-β1 25、50、100 ng/μl组显著降低(P<0.05)，见表1。

表1 各组血清中TNF-α、iNOS水平比较

与Control组比较：1)P<0.05；与PD组比较：2)P<0.05；同表2，表3

2.3黑质部神经元、小胶质细胞数量 与 Control组相比，PD组黑质部神经元数量显著减少，小胶质细胞数显著升高(P<0.05)；与PD组相比，TGF-β1 25、50、100 ng/μl组黑质部神经元数量显著升高，小胶质细胞数显著减少(P<0.05)，见图1、表2。

图1 免疫组化法检测黑质部神经元及小胶质细胞变化(×100)

表2 各组黑质区神经元、小胶质细胞数量比较个/视野，n=10)

2.4各组黑质区TGF-β1、Smad3蛋白表达比较 与Control组相比，PD组TGF-β1、Smad3蛋白表达显著降低(P<0.05)；与PD组相比，TGF-β1 25、50、100 ng/μl组显著升高(P<0.05)。见图2、表3。

2.5各组小胶质细胞控制率比较 与空白组〔(13.61±0.88)%〕相比，LPS组小胶质细胞抑制率〔(1.66±0.08)%〕显著降低(P<0.05)；与LPS组相比，TGF-β1 2、5、10 ng/μl组〔(3.42±0.83)%、(6.76±1.04)%、(9.44±1.76)%〕显著升高(P<0.05)。

图2 黑质部组织TGF-β1、Smad3蛋白表达

表3 各组黑质区TGF-β1、Smad3蛋白表达比较

2.6小胶质细胞形态观察 与空白组相比，LPS组小胶质细胞胞体明显增大，细胞固缩，细胞被激活；TGF-β1 2、5、10 ng/μl组小胶质细胞胞体体积明显减小，胞体突起变细。见图3。

图3 荧光显微镜观察小胶质细胞形态变化(×200)

2.7各组细胞CD11b、TGF-β1、Smad3蛋白表达比较 与空白组相比，LPS组细胞TGF-β1、Smad3蛋白表达明显降低，CD11b蛋白表达显著升高(P<0.05)。与LPS组相比，TGF-β1 2、5、10 ng/μl组TGF-β1、Smad3蛋白表达明显升高，CD11b蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图4、表4。

图4 细胞CD11b、TGF-β1、Smad3蛋白表达

组别TGF-β1 Smad3CD11b空白组1.04±0.761.22±0.230.24±0.06LPS组0.14±0.031)0.13±0.041)0.89±0.131)TGF-β1 2 ng/μl组0.23±0.042)0.39±0.052)0.74±0.122)TGF-β1 5 ng/μl组0.45±0.052)0.72±0.162)0.61±0.152)TGF-β1 10 ng/μl组0.56±0.072)0.98±0.192)0.36±0.062)

与空白组比较:1)P<0.05；与LPS组比较:2)P<0.05

3 讨 论

PD病理特征主要为黑质部多巴胺神经元丢失、变性，致使纹状体多巴胺水平降低，患者临床一般表现为行动缓慢出现静止性震颤。目前PD动物模型制备主要采用6-OHDA注射一侧纹状体，经神经元轴突末梢吸收后，6-OHDA损坏黑质部神经元，进而模拟早期PD临床病理表现〔7〕。本研究模型制备与以往PD模型制备结果相符合〔8〕，提示大鼠PD模型制备成功。TGF-β1是具有多功能生长调节蛋白，研究显示其在神经损伤、伤口溃烂修复再生等多病病理过程中发挥重要调控功能〔9〕。体外研究显示神经元培养时添加TGF-β1可显著提高存活率，促进雪旺细胞(SCs)细胞增殖，加速轴突髓鞘形成〔10〕。在中枢神经系统中添加TGF-β1可刺激星形胶质细胞产生，加速神经元生长、分化进程〔11〕。目前关于TGF-β1体内作用目前报道较少，本研究通过制备PD模型后给予外源TGF-β1治疗，结果表明TGF-β1对PD大鼠神经具有一定的保护作用，但具体作用机制尚不明确。小胶质细胞大量分布于脑皮层黑质部，研究证实小胶质细胞炎症反应与PD的发生密切相关〔12〕。Ouchi等〔13〕采用放射性追踪剂11CPK11195对PD者行正电子发射计算机断层扫描(PET)检查，结果显示神经元的变性缺失与小胶质细胞的激活有关。在脑部受损、出现炎症反应或受到免疫刺激后，黑质部小胶质细胞激活后上调细胞表面标志物，引发神经元缺失〔14〕。以上研究均显示黑质部神经元受损过程中，小胶质细胞活化发挥决定性作用。本研究免疫组化结果表明，外源给予TGF-β1能够抑制小胶质细胞的产生。为进一步探究TGF-β1对小胶质细胞活化抑制作用，本研究体外研究结果推测，TGF-β1能够抑制PD引发的小胶质细胞激活，进而发挥其对神经系统的保护作用，但对下游炎症因子是否有影响，目前尚不清楚。

研究显示，PD神经元损伤后可释放大量细胞坏死物，刺激小胶质细胞活化，产生大量环氧化酶(COX)-2及炎性因子TNF-α，进一步介导细胞毒性激活iNOS合成大量NO损伤神经元〔15〕。动物研究显示，在大鼠小胶质细胞培养过程中，LPS激活组细胞上清液中TNF-α、NO水平明显升高，添加促红细胞生成素(EPO)后可抑制NO生成，降低炎症反应〔16〕。本研究结果提示，TGF-β1可能通过降低TNF-α、iNOS水平，抑制炎症反应，发挥神经保护作用。近期有研究指出TGF-β1/Smads信号通路可能与PD的发生有关〔17〕。TGF-β1通过与膜受体结合后，使受体磷酸化，将信号转入细胞内，激活Samd3蛋白磷酸化，随后与Smad4形成复合物转入细胞核内，进而调控靶基因转录活性。体外研究显示，TGF-β1/Smad3信号通路参与谷氨酸介导神经元损伤〔18〕。Zhang等〔19〕研究显示，TGF-β1具有神经保护功能，体外培养神经元或胶质细胞时过表达TGF-β1可抵御神经损伤，中枢神经系统中研究显示过表达TGF-β1后可能对抗β淀粉蛋白诱导神经变性具有一定的抵御作用。动物研究显示Smad3基因缺陷型小鼠脑补神经前提细胞迁移受到明显阻碍，且神经系统发育异常〔20〕。Wang等〔21〕研究发现，Smad3基因缺陷型小鼠黑质部神经元缺失、变性数量明显降低。以上研究均提示TGF-β1/Smad3与神经损伤关系密切。本研究结果提示外源TGF-β1可激活TGF-β1/Smad3信号通路进而抑制小胶质细胞的活化，发挥神经保护功能。

综上，外源TGF-β1可能通过介导TGF-β1/Smad3信号通路抑制小胶质细胞活化，降低炎症因子表达，减轻PD大鼠神经损伤，保护神经功能。