水疱性口炎病毒纯化抗原制备多克隆抗体的检测结果分析

胡涛 金郁 汪学龙 李群

水疱性口炎病毒(VesicularStomatitisVirus, VSV)可引起人畜共患疾病，是猪、牛、马等口腔黏膜、皮肤、乳头及蹄冠部皮肤出现水泡及糜烂为特征的一种病毒性疾病[1]，人类也可以偶尔感染VSV，引起类似急性流感样的症状。一周后康复并产生中和抗体，是影响人类的卫生健康病毒之一[2]。近年来，该病在我国也有自然发生的报道[3]。目前，常见VSV检测方法主要有病毒分离培养鉴定、血清中和试验、酶联免疫吸附(ELISA)试验等方法[4]。本研究采用纯化的抗原制备兔抗VSV多克隆抗体，通过血清中和试验、间接ELISA等试验方法检测其抗体效价的结果分析，可作为VSV的血清学检测提供依据和流行病学调查提供技术分析。

材料与方法

一、病毒株与细胞株

水泡性口炎病毒(VSV)毒株、Vero细胞株均由安徽医科大学微生物教研室提供。

二、动物

大耳白兔由安徽医科大学实验动物中心提供[SYXK(皖)2017-006]。

三、仪器设备

倒置生物显微镜(OLMPCUS-CKX41，日本产)、酶标仪(Biotek-EL808，美国产)、CO2孵箱(日本产)。

四、主要试剂

HRP标记羊抗兔IgM为北京中杉金桥生物技木有限公司产品，完全佐剂和不完全佐剂由安徽芜湖天明生物技术有限公司提供，包被液、抗体稀释液、封闭液、显色液、底物液、终止液均由安徽医科大学微生物学教研室自制。

五、VSV病毒的纯化

将VSV接种于Vero单层细胞，细胞病变(CPE)达80%以上时收获病毒，冻融3次后，3 000 r/min离心 30min，除去细胞碎片；再经5 000 r/min 离心30 min，取上清以30 000 r/min 4℃离心3 h，弃上清，将沉淀用少量PBS充分悬浮，获得纯化病毒,测定其浓度及毒力并分装保存于-80℃备用。

六、兔抗VSV多克隆抗体的制备

实验用体重为2～3 kg雄性清洁级大耳白兔，无感染疾患共6只，分笼饲养，标明记号(a、b、c、d、e、f)，免疫前健康观察1周，耳静脉采血，分离血清，作为阴性对照。免疫将纯化的病毒稀释至1.5 mg/mL后与等量的弗氏完全佐剂乳化，背部皮下多点注射清洁级大耳白兔，每只注射2 mL；1周后用VSV加弗氏不完全佐剂皮下多点注射加强免疫1次，剂量与初次免疫相同，后三次免疫兔耳静脉注射1 mL，免疫共35 d，兔心脏抽血离心分离血清。进行双向琼脂扩散试验、间接ELISA方法、中和试验检测其抗体效价。

七、 兔抗VSV多克隆抗体的检测方法

1. 双向琼脂扩散实验：用灭菌生理盐水配制成1%琼脂融化后，倾注于每张清洁载玻片上5 mL。正六角形打孔，孔距3～5 mm，孔径3 mm。将琼脂板标明记号，分别稀释待测血清原液、1 ∶ 2、1 ∶ 4、1 ∶ 8、1 ∶ 16、1 ∶ 32。加样：中央加1 ∶ 2的VSV抗原。其它6孔注入上述不同稀释度VSV免疫血清。将琼脂板平置于盒内，于室温24h观察结果。

2. 间接ELISA法：将上述VSV抗原上清液按文献纯化抗原，加96孔酶标板中作方阵滴定[5]，获合适浓度，用PH 9.6碳酸缓冲液包被抗原，设正常抗原孔，每孔75 μL，4℃过夜，10%小牛血清封板1 h后，洗涤甩干备用。待测免疫血清(a、b、c、d、e、f)分别按1 ∶ 10不同浓度倍比稀释、每孔75 μL，放置37℃ 1 h，洗涤3次后，二抗为HRP标记羊抗兔IgM，用封板液稀释1 ∶ 5000，每孔75 μL，37℃ 1 h后洗涤3次，显色：TMB A液及B液每孔各25 μL，与正常抗原孔比较，正常抗原孔不显色，其他显蓝色为阳性。以未免疫兔血清做阴性对照，以待测血清OD值/阴性对照OD值(P/N)2.1作为阳性标准，以出现阳性反应最高稀释度作为该血清的抗体效价(滴度)。

3. 中和试验测定效价：预先将被检血清(a、b、c、d、e、f)58℃30 min灭活。在平底微量细胞培养板中从1 ∶ 4开始，每份血清用两排孔，第一孔加入100 μL，稀释至第9孔吸出100 μL弃去。第10孔细胞对照，第11孔病毒对照，均不加血清。用反复冻融3次后收集培养液VSV病毒悬液，按Reed—Muench法测定该TCID50[6]，每孔100 μL加入，血清S对照及C细胞对照(即第1、10孔)不加病毒，V病毒对照加100 TCID50100 μL。每孔总量200 μL，C对照及S对照补充稀释液100 μL/孔。37℃1 h，分别将1×106/mL Vero细胞悬液100 μL加入每孔，置于5%二氧化碳环境中，37℃培养48 h观察细胞病变效应(CPE)。

4. 三种试验方法的结果分析比较：将6份VSV免疫血清的双向琼脂扩散试验和间接ELISA效价与中和试验效价结果相比较，探索其相关性。

结 果

一、VSV病毒的纯化

将细胞培养的VSV用差速离心及超速离心纯化后，紫外分光光度计测其蛋白浓度为3.08 mg/mL。VSV接种Vero细胞的感染滴度为10～5/0.1mL。

二、VSV抗原免疫接种后兔临床症状

观察兔发病出现消瘦、腹泻、食欲减退或不食。局部的皮肤发生炎症和脱毛、唇、口腔黏膜等处出现水疱，水疱破溃，形成烂斑等症状。

三、兔抗VSV多克隆抗体的双向琼脂扩散试验

观察中间孔为VSV抗原，周围孔为不同稀释的免疫血清抗体，以出现沉淀线的最高稀释为抗体效价，出现沉淀带完全融合证明同种抗原，二者有部分相连表明二者有共同抗原决定簇，二条沉淀线相互交叉说明二者抗原完全不同。结果见图1(a、b)，免疫血清检测抗体效价结果分别为a 1 ∶ 16、b 1 ∶ 16、c 1 ∶ 8、d 1 ∶ 16、e 1 ∶ 16、f 1 ∶ 32。

图1 a, b兔抗VSV多克隆抗体的双向琼脂扩散结果图

四、兔抗VSV多克隆抗体的ELISA法

抗原和血清工作浓度，确定兔抗VSV作方阵滴定的抗原最佳包被浓度为1 ∶ 800(5.16wg/mL)；酶标二抗的最佳稀释度为1 ∶ 5 000，在37℃ 1 h后4℃包被过夜、血清最佳工作浓度为1 ∶ 40时效果最好。检测结果显示，VSV的纯化病毒与6组VSV免疫血清发生特异性反应，与其他阴性血清不存在特异性反应。

五、兔抗VSV多克隆抗体的中和试验测定效价

用倒置生物显微镜观察结果，以病变CPE作为指标，首先观察细胞对照(-)，病毒对照(++++)、血清对照(-/+-)，见图2。a，b组VSV免疫血清中和试验测定效价结果见图3。能抑制病毒CPE的血清最高稀释度为中和抗体效价(滴度)见表1。

A. 细胞对照 B. VSV滴度 C. 血清对照 D. 病毒对照

C. 细胞对照 A. 病毒对照 S. 血清对照 1-9VSV滴度

六、兔抗VSV多克隆抗体试验方法结果的分析

6份VSV免疫血清，三种方法测血清效价及分析中和试验结果比较显示，双向琼脂扩散试验出现沉淀带完全融合证明同种VSV抗原；中和试验结果显示病毒回归成立，正常对照细胞生长良好。VSV免疫血清间接ELISA和中和试验，检测血清的阴性对照、阳性对照相同。

表1 VSV-双向琼脂扩散和ELISA及中和抗体试验的结果比较

讨 论

VSV的天然宿主为猪、马、牛等家畜，可引起严重水泡性病变甚至死亡[7]。本实验采用纯化的全病毒免疫，实验证明兔可被VSV感染并出现临床症状，可用来分析VSV致病性与实验结果之间的关系。纯化的全病毒抗原免疫动物，可获得抗病毒所有结构蛋白的特异性抗体，而抗体的效价和纯度是影响ELISA敏感性的因素[8]，因此，在实验中用纯化的全病毒，以获得抗VSV结构蛋白的特异性抗体，并进行了双向琼脂扩散试验和间接ELISA与中和抗体之间的试验，结果表明：双向琼脂扩散试验出现沉淀带完全融合，证明是同种VSV抗原。中和试验正常对照细胞生长良好，VSV回归成立。间接ELISA以最大可能降低非特异性反应，从而提高敏感性，结果背景值低。通过间接ELISA和中和试验方法结果观察分析比较，两者检测血清阴性对照和阳性对照结果一致，中和试验特异性好、敏感性更高，中和试验为检测VSV感染的诊断基本方法。建立研究兔抗VSV多克隆抗体试验方法和结果，可作为VSV血清学的检测提供依据和流行病学调查提供技术保障。