新疆江鳕染色体核型分析和形态特征研究

周剑光，蒋艳琳，张 林，王昱斌，张 涛，阿达可白克·可尔江，郭 焱，杨天燕

(1.中国水产科学研究院长江水产研究所，农业农村部水产品质量安全风险评估实验室(武汉)，武汉 430223；2.浙江海洋大学水产学院，浙江舟山 316022；3.新疆维吾尔自治区水产科学研究所，乌鲁木齐 830000)

江鳕(LotalotaLinnaeus)，别名山鲶鱼、山怀子，隶属鳕形目(Gadiformes)鳕科(Gadidae)江鳕属Lota。江鳕属于北极淡水区系复合体的鱼类，也是鳕科鱼类中唯一的淡水经济种，广泛分布于北纬45度以北的欧洲、亚洲以及北美洲的内陆水域，在我国仅分布于东北的黑龙江水系、鸭绿江上游以及新疆的额尔齐斯河[1-2]。作为高寒水域冷水性珍稀鱼类，江鳕因其肉质鲜美、营养价值高，常被视为美味佳肴，具有较高的经济价值、药用价值和特殊的科学研究价值[3-5]。

由于江鳕的自然产量较低且市场消费需求较大，近年来过度捕捞及自然环境改变，导致天然水域江鳕个体趋于低龄化和小型化，且群体数量减少、分布范围缩小、遗传多样性降低，已列入《中国珍稀野生动物名录》和《黑龙江省地方重点保护野生动物名录》[6]。目前关于江鳕的研究主要涉及形态测定、繁殖发育以及遗传变异等方面[7-11]，而对其染色体的研究国内尚未见相关报道。存在于细胞核中的染色体是生物遗传物质的主要载体，也是细胞遗传学研究的重要内容[12]。研究鱼类染色体及其核型，不仅有助于分析鱼类遗传变异与组成、发育机制以及系统演化等方面的全方位深入了解，也可以对种间杂交和多倍体育种进行预测与鉴定[13]。因此，开展江鳕这一珍稀冷水鱼类的染色体核型分析研究，不仅对其种质资源的判别鉴定具有重要意义，也可为其生殖繁衍和人工育种提供理论依据。本研究对新疆额尔齐斯河流域的野生江鳕染色体核型进行测定和分析，研究结果将有助于补充江鳕细胞遗传学数据信息，同时也为我国高寒水系的鱼类遗传育种及人工繁殖提供参考资料。

1材料与方法

1.1 试验材料

江鳕于2017年7月采自新疆额尔齐斯河水系的布尔津河流域(图1)，选取成熟健壮、体表完好、体质良好的活体试验样品54尾。用直尺和游标卡尺测量样品体长、头长、体高、头高、吻长、眼径、眼间距、尾柄长、尾柄高，精确至 0.1 cm；用电子天平测量样品体质量，精确至 0.1 g。测得样品体长在20.3～56.1 cm之间，单尾体质量在230.0～1 860.0 g之间。用于江鳕染色体制备的10尾(5雌5雄)样品于2018年2月采自新疆额尔齐斯河水系的布尔津河流域，单尾体质量在80.5～151.6 g之间。

图1 采样地点图(▲为采样点)Fig.1 Sampling location of L.lota

1.2 染色体标本制备

染色体标本制备采用林义浩[14]的体内注射肾细胞法，稍作修改，方法如下：(1)实验前先将江鳕暂养于水族箱中，使水温以及pH值保持在适宜范围，将气石与过滤棉放置于缸内，确保溶氧量充足和水质干净。(2)注射PHA(植物血球凝集素)：自实验鱼胸鳍基部注射PHA,剂量10～15μg/g(鱼体质量)。(3)注射秋水仙素：注射PHA 20～24 h后，每1 g鱼体质量注射3～5μg秋水仙素。(4)制备细胞悬液：注射秋水仙素2～4 h后，剪开江鳕的鳃部动脉，放血20 min，取江鳕头肾,用生理盐水反复洗涤3～4次，将组织剪碎、过滤细胞悬液，再放入离心管中，以1 200 r/min离心10 min，得到沉淀的江鳕头肾细胞。(5)低渗处理：往离心管加入5 mL的0.075 mol/L的KCl低渗液，低渗处理50～60 min，再以1 200 r/min的速率离心10 min。(6)固定处理：将预冷新配的卡诺氏固定液(甲醇∶冰醋酸 = 3∶1)，量取5 mL加入到刚弃去上清液的沉淀细胞中，用吸管吹打均匀，固定20 min后再以1 200 r/min的速率离心10 min。再重复固定2次，每次20 min。(7)滴片处理：将细胞悬浮液滴于预冷载玻片上，随后将载玻片在酒精灯上过火2～3次后放置透风透气处自然风干。(8)染色处理：将风干的染色体玻片放入浓度为10%吉姆萨(Giemsa)染色液中染色30 min，用蒸馏水将玻片反面冲洗干净，自然风干后镜检。

1.3 染色体众数确定及组型分析

染色体众数确定及组型分析参照TAN等[15]方法进行，稍加修改，方法如下：

1.3.1 染色体众数确定

选取来自不同个体的110个分散良好的细胞，用显微镜(油镜)进行观察、拍照，根据众数确定江鳕二倍体染色体数目。

1.3.2 组型分析

挑选 10个数目完整、分散良好、长度适中(正中期)、着丝点清楚、2条染色单体适度分开、形态清晰的分裂相进行显微摄影，在相片上对每一条染色体确认着丝点位置，分别测量长臂和短臂，测量数据取其平均值。计算其相对长度、臂比值和着丝点指数，并按LEVAN等[16]提出的标准进行配对、分类、排列组型。

2 结果

2.1 江鳕形态特征

2.1.1 外形

江鳕外部形态见图2所示。江鳕体圆长形，后部侧扁。头稍扁平。体背部及体侧上部灰褐色，腹部灰白色，体侧与鳍条上散布不规则的黄白色斑点。吻钝，口端位。下颌略长于上颌。眼小，眼间距平宽。颏部正中具颏须1枚，两鼻孔分离，前鼻管突出，具鼻须1对。鳃盖膜分离，不与峡部相连。体被小圆鳞。侧线前部较高，后部侧中位，且常不完全。背鳍两个，前背鳍短小，后背鳍基长几与尾鳍相接。胸鳍扇形。腹鳍喉位，第1～2鳍条略延长呈丝状。臀鳍基起点稍后于背鳍，后端与尾鳍相接或稍分离。尾鳍椭圆形。

图2 江鳕外部形态图Fig.2 Morphological characteristic of L.lota

2.1.2 可数性状

江鳕背鳍鳍式：D.i～iii-10～13，i～ii-65～92；胸鳍鳍式：P.i-16～17；腹鳍鳍式：V.0-7；臀鳍鳍式:A.0-64～84；左侧第一鳃弓外侧鳃耙数：8～12。

2.1.3 可量性状

测量了54尾体长20.3～56.1 cm江鳕的体长、头长、体高、头高、吻长、眼径、眼间距、尾柄长和尾柄高数据，其可量性状比值见表1。

表1 江鳕可量性状比值

2.1.4 内部构造特征

江鳕鳔一室，前端分小叉，后部稍大。脊椎骨总数为58～67。腹膜银白色。

2.2 体长和体质量关系

分析江鳕体长和体质量回归曲线呈幂函数关系(图3)，额尔齐斯河江鳕体长与体质量关系符合指数增长形式，二者关系可用公式W=0.016L2.782(R2=0.960)表示。式中W为体质量(g) ，L为体长(cm)。根据回归方程将各龄鱼的逆算平均体长代入体长-体质量关系式，求得各龄鱼平均体质量范围为：2龄鱼体质量48.2～530.3 g、3龄鱼体质量62.0～678.2 g、4龄鱼105.2～935.6 g、5龄鱼238.5～1 675.5 g。

图3 江鳕体长与体质量关系Fig.3 Relationships between body length(L)and body weight(W)of L.lota

2.3 江鳕染色体数目和核型

2.3.1 江鳕二倍体染色体数目

统计10尾江鳕共110个染色体中期分裂相的结果(表2)，其中染色体总数为48的分裂相细胞占全部计数细胞的74.5%，由此确定江鳕的二倍体染色体数目为2n=48(图4)。

表2 江鳕染色体数目的分布

图4 江鳕染色体中期分裂相图谱Fig.4 Metaphase chromosome of L.lota

2.3.2 江鳕的染色体组型

根据对江鳕染色体相对长度和臂比的统计结果(表3)，其全部48条染色体可配成24对，按LEVAN等[16]命名法分成 4组，m组(中部着丝点染色体，r=1.00～1.70)6对；sm组(亚中部着丝点染色体，r=1.71～3.00)9对；st组(亚端部着丝点染色体r=3.01～7.00)7对；t组(端部着丝点染色体，r=7.01～∞)2对。其相对长度最长可以达到6.83±0.31，而最短为2.06±0.17。按相对长度排列，制成江鳕染色体组型图(图5)，核型公式为 2n=12m+18sm+14st+4t，臂数(NF)=78。从图5可以看出，在江鳕的m组中，有一对相对本组其他染色体明显较大的染色体，除此之外，各相邻两对染色体之间无明显差异，大小呈递减趋势排列。4组染色体均未发现带有特殊标志性特征如随体、次缢痕的染色体，也未发现与性别决定有关的异形性染色体。

图5 江鳕染色体核型Fig.5 Karyotype of L.lota

序号相对长度臂比着丝粒指数染色体类型16.83±0.311.13±0.0146.99±0.24m25.00±0.211.47±0.0340.54±0.48m34.64±0.791.37±0.1742.18±2.86m44.05±0.281.54±0.0339.39±0.49m53.91±0.221.23±0.1544.91±2.89m63.85±0.281.35±0.0442.54±0.78m75.27±0.402.32±0.0330.13±0.28sm85.23±0.392.14±0.0131.81±0.05sm95.01±0.072.49±0.0228.63±0.17sm104.38±0.022.12±0.0732.05±0.73sm114.29±0.182.01±0.0533.18±0.53sm124.20±0.582.69±0.0627.07±0.43sm133.77±0.222.13±0.1531.98±1.49sm143.64±0.142.05±0.0132.81±0.15sm153.62±0.112.11±0.0732.19±0.73sm164.36±0.203.22±0.1123.68±0.59st174.34±0.164.10±0.0719.61±0.25st183.93±0.253.52±0.1422.14±0.71st193.74±0.134.14±0.0319.44±0.10st203.74±0.233.39±0.0922.76±0.46st213.44±0.233.44±0.0822.50±0.40st223.29±0.374.13±0.0919.48±0.33st233.42±0.15∞∞t242.06±0.17∞∞t

注：平均值±标准差

3 讨论

按照鱼类体长-体质量关系曲线方程，当a值越大时鱼体越肥硕；b值大于或小于3时，鱼类呈异速生长[17]。通过实测数据分析，本研究中江鳕体长-体质量关系式中幂指数值小于3(b=2.782)，表现出体长增长快于体质量增长的异速生长，且推算出的1～2龄鱼体长、体质量的相对增长率均高于性成熟时的3～4龄鱼，表明江鳕在性成熟前生长速度相对较快，而性成熟后各项指标均呈现下降趋势，增长变缓，符合一般鱼类的生长规律[18-19]。不同地理分布区内的江鳕形态特征存在一定差异。Hubbs等[20]最早提出将江鳕分为江鳕指名亚种(L.lotalota)、细尾江鳕亚种(L.lotaleptura)和北美斑江鳕亚种(L.lotamaculosa)三个亚种，并将胸鳍长度作为指名亚种区分其他两个亚种的分类特征。按照该标准，新疆额尔齐斯河江鳕被划为指名亚种，而黑龙江流域的江鳕系统分类地位尚不明确，或许处于指名亚种的边缘[21]。张俊丽等[11]通过对分布于黑龙江多布库尔河和新疆额尔齐斯河的江鳕形态特征比较研究发现，38项量度特征和分节特征中有28项达到差异显著水平(P<0.05)、26项达到差异极显著水平(P<0.01)，从而进一步证实了二者可能属于不同亚种。

染色体与核型分析对研究鱼类遗传和进化具有至关重要的意义。化石证据和分子遗传学资料显示，作为世界上唯一在淡水中分布的鳕形目鱼类，早在5～15百万年前江鳕就已存在于欧洲的天然水域，并随后扩散到北美各大水系[22]。Ohno[23]研究认为，具有48条单臂染色体核型的鱼类是硬骨鱼类中较原始的类群，物种的核型演化主要通过染色体重排(Chromosomal rearrangement)进行。例如，有研究证实染色体臂间倒位(Pericentric inversions)在三刺鱼(Gasterosteusaculeatus)对淡水生存环境适应过程中发挥了重要作用[24]，推测江鳕染色体结构在进化过程中可能也经历了一系列融合、倒位和重组变化，通过增加其染色体臂数以适应淡水生活。

已有的研究表明，二倍体鳕科(Gadidae)鱼类染色体数目从宽突鳕属(Eleginus)的13对到平头鳕(Ranicepsraninus)、细长臀鳕(Trisopterusminutus)和江鳕(L.lota)的24对不等，染色体臂数也有NF=48和NF=78之别[25]。李树深[26]通过研究发现，利用着丝粒染色体和臂数数目可以划分不同鱼类类群，具有较多的端部着丝粒染色体的鱼类属于原始类群，而具有较多中部或亚中部着丝粒染色体的鱼类则属于特化类群，染色体臂数多的类群较之臂数少的类群更为特化。通过观察比较得知，江鳕的染色体臂数较其他鳕科鱼类数量多，且具有较多中部与亚中部着丝粒染色体，推测江鳕可能是鳕科鱼类中较晚分化出来的，在进化上属于较为特化的类群。另外，按照腹鳍着生的位置对应鱼类在进化中出现的先后顺序与物种的地位，腹鳍腹位的鱼类属于较原始的类群，而腹鳍胸位和腹鳍喉位在鱼类进化中出现相对较晚，与之对应的鱼类进化更完善，并且这些特征的出现增强了相应物种对环境的适应性，较之腹鳍腹位这一早期形式更高级[19]。因此，该角度也从一个侧面印证了江鳕在进化上更为特化。