中华鳖NR5a2基因的克隆与表达分析

张 超，马 晓，刘 倩，吴利敏，刘慧芬，李学军，王璐明

(河南师范大学水产学院，河南新乡 453007)

NR5a2(nuclear receptor subfamily 5，group A，member 2)又称LRH-1(肝受体同系物)，是一种孤核受体，也是需要配体激活的转录因子。在小鼠[1](Musmusculus)、牙鲆[2](Paralichthysolivaceus)、赤点石斑鱼[3](Epinephelusakaara)中发现NR5a2可以结合Cyp19a1a启动子，进而激活其转录活性。此外，在牙鲆中还发现NR5a2可以与Foxl2协同作用，调节Cyp19a1a的转录表达[2]。当NR5a2仅在赤点石斑鱼成熟卵巢细胞细胞质中表达时，Cyp19a1a基因的表达水平下降[3-4]。Cyp19a1a基因编码的芳香化酶是雄激素转换为雌激素的关键限速酶，而雌激素在脊椎动物卵巢分化，雌性性别特征的维持中有重要的作用。NR5a2作为Cyp19a1a转录因子之一，对Cyp19a1a基因的表达也有一定的调节作用，深入研究NR5a2和Cyp19a1a在性别分化中的功能具有重要意义。

中华鳖(Pelodiscussinensis)，又称甲鱼、水鱼、团鱼等，隶属于龟鳖目(Testudinate)鳖科(Tironychidae)中华鳖属(Pelodiscus)，是我国广泛养殖的名贵水产品之一，具有较高的营养价值和药用价值。目前对中华鳖的研究多集中在性别决定与分化、免疫和营养等方面[5-7]。爬行动物的性别决定有基因型性别决定(GSD)和环境性别决定类型(ESD)。前期研究多认为中华鳖属于ESD中的TSD类型，随着研究发展深入，越来越多证据表明中华鳖属于GSD型[8]。养殖过程中，雄鳖比雌鳖生长速度快。因此，深入研究中华鳖性别分化与发育机制，有助于建立提高雄鳖孵化率或全雄鳖培育方法，对中华鳖养殖业发展有重要意义。本实验克隆了中华鳖NR5a2基因，通过实时荧光定量PCR技术研究中华鳖NR5a2基因在不同组织以及不同时期胚胎中的表达，为进一步研究其功能提供依据，也为中华鳖性别发育研究提供资料。

1 材料与方法

1.1 实验用中华鳖组织及胚胎的收集

本实验所选用的成熟雌性/雄性中华鳖和受精卵采自固始县晨源水产养殖合作社，随机选取成熟雌性、雄性中华鳖各6只，分别取心脏、肝脏、脾脏、脑、胃、肌肉、精巢、卵巢组织置于无酶管中，后将组织存放在-80 ℃冰箱备用。受精卵通过恒温恒湿培养箱进行孵化，孵化温度为31.5 ℃，湿度控制在75%～90%。孵化过程中根据中华鳖胚胎发育图谱[9]收集性腺分化前后不同时期(16-23期)[10-11]性腺-中肾复合体(AKG)，每个时期取6个样品。

1.2 中华鳖NR5a2基因全长的克隆

1.2.1 引物设计

根据Ensemble数据库中的中华鳖NR5a2基因cDNA序列(ENSPSIG00000003632.1)设计引物F1/R1进行cDNA序列的验证，同时设计GSP 5′/NP5′和GSP3′/NP3′引物用于基因全长的克隆(表1)。此外，根据克隆得到的中华鳖NR5a2基因cDNA全长设计特异性引物用于荧光定量PCR表达实验。在荧光定量PCR实验中选用的内参基因为GAPDH[9,12]。引物通过Primer 5.0 设计，由上海生工生物技术有限公司合成。

表1 实验中所用引物序列

1.2.2 RNA的提取和NR5a2的克隆

取卵巢组织以及不同发育时期个体AKG，RNAiso plus(TaKaRa，大连)提取总RNA。ND-2000核酸蛋白仪测定RNA浓度与OD值，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，总RNA置于-80 ℃保存。按照Prime ScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa，大连)的操作说明进行中华鳖卵巢总RNA反转录，通过特异性引物NR5a2-F1/R1扩增NR5a2 cDNA部分序列。在已获得部分序列的基础上设计3′ RACE 和5′RACE的基因特异性引物(表1)，按照SMART 5′ RACE & 3′ RACE 试剂盒(TaKaRa，大连)说明书合成3′-RACE-Ready cDNA和5′-RACE-Ready cDNA，分别进行3′非编码区和5′非编码区的扩增。将扩增结果进行克隆、测序，获得所需片段并进行拼接，得到该基因cDNA序列全长。

1.3 中华鳖NR5a2基因的序列分析

利用DNAman软件对中华鳖NR5a2基因的测序结果进行拼接；利用Open Reading Frame(ORF)Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)推算其开放阅读框及编码的氨基酸序列；通过SignalP 4.1 serves(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测其信号肽结合位点； SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)进行蛋白质结构域分析；使用ClustalX2进行氨基酸序列同源性比对；运用MAGA7.0软件通过邻接法(NJ法)(bootstrap values为1 000)构建系统进化树。

1.4 qRT-PCR分析中华鳖NR5a2基因的组织特异性表达

按照Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒(TaKaRa，大连)操作说明进行不同发育时期性腺中肾复合体RNA的反转录，选用特异性引物qNR5a2-F/R(表1)进行qRT-PCR，以GAPDH为内参基因(表1)。反应体系(10 μL)：TB Green Master Mix 5 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 3.2 μL；PCR反应程序：95 ℃ 预变性30 s，95 ℃ 变性5 s，58 ℃ 退火30 s，40个循环，每个组织分别取自3只中华鳖，即3个平行。采用2-△△Ct法计算中华鳖NR5a2基因的相对表达量，结果采用SPSS16.0软件进行ANOVA单因素方差分析，以平均值±标准误(Mean±SD)表示。

2 结果分析

2.1 中华鳖NR5a2基因序列分析

本实验克隆得到中华鳖NR5a2基因cDNA序列全长为2 674 bp，开放阅读框长1 608 bp,编码535个氨基酸，5′-UTR长40 bp，3′-UTR长1 026 bp(图1)。使用ProtParam预测该基因编码的蛋白质分子质量为60.5 kDa，等电点为8.57。

图1 中华鳖NR5a2基因序列和氨基酸序列Fig.1 Full-length nucleotide cDNA sequences and deduced amino acid sequences of NR5a2 in P.sinensis小写字母表示5′和3′非编码区；大写字母表示编码区。预测的结构域ZnF-C4用下划线表示，预测的结构域HOLI由阴影区表示，*表示终止密码子。

对中华鳖NR5a2编码的氨基酸序列进行分析，发现该序列无明显信号肽位点，也不存在蛋白跨膜区域。在疏水性/亲水性分析中发现其疏水性残基比例大于亲水性残基比例，其中疏水性最大值为-2.778，亲水性最大值为2.411。SMART分析表明中华鳖NR5a2含有一个保守的ZnF-C4结构域和一个保守的HOLI结构域(图2-A)。通过 DNASTAR.Lasergene.v7.1 软件中的Protean程序对中华鳖NR5a2基因蛋白质二级结构组成进行预测，其蛋白质二级结构中的Alpha螺旋、Beta折叠、Turn转角以及Coil卷曲螺旋分布如图所示(图2-B)，结果表明该蛋白质二级结构主要由Alpha螺旋和Coil卷曲螺旋构成，分别占45.61%和45.05%。SWISS-MODEL在线预测软件对中华鳖NR5a2基因编码蛋白质的三级结构进行预测结果如图所示(图2-C)。

2.2 中华鳖NR5a2基因氨基酸同源性分析及系统发育树的构建

使用Megalign软件进行中华鳖NR5a2氨基酸序列与其他物种NR5a2氨基酸进行比对(图3)。结果表明中华鳖与西部锦龟的相似性最高，为99.2%，其次是原鸡，相似性为98.4%(表2)。通过MEGA5.1软件，采用邻接(Neighbor-Joining)法构建系统发育树(图4)。结果显示中华鳖与西部锦龟的进化关系最近，其次是原鸡、紫翅琼鸟和扬子鳄。

图2 NR5a2编码氨基酸序列分析Fig.2 The sequence analysis of protein of NR5a2A：NR5a2编码蛋白结构域预测；B：NR5a2编码蛋白质二级结构预测；C：NR5a2编码蛋白质三级结构预测。

图3 不同物种NR5a2基因氨基酸同源性比较Fig.3 Alignment of amino acid sequences of NR5a2 gene in different species使用Megalign软件进行多序列对比，其中黑色底纹代表氨基酸相似度为100%，灰色底纹代表氨基酸相似度为75%。

表2 预测的中华鳖NR5a2氨基酸序列与其他物种NR5a2氨基酸序列的比对

图4 NR5a2基因编码氨基酸序列系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree based amino acid sequences of NR5a2

2.3 中华鳖NR5a2基因的组织特异性表达及不同发育阶段变化

荧光定量PCR结果表明，NR5a2基因在中华鳖的心脏、肝脏、脾脏、脑、胃、肌肉、精巢、卵巢中均表达。其中，在肝脏中表达量最高，其次是卵巢，在肝脏和卵巢组织中NR5a2的相对表达量显著高于其他组织(P<0.05)(图5)。31.5 ℃条件下孵育，在中华鳖胚胎发育不同时期均在AKG中检测到NR5a2表达，在胚胎发育17期(性腺分化开始阶段)时表达量最高，随着发育的进程表达量显著下降(图6)。

图5 NR5a2基因在中华鳖不同组织中的相对表达量Fig.5 Real-time PCR quantification of NR5a2 expression in different tissues of P.sinensis不同小写字母表示NR5a2基因在不同组织中的差异显著性(P<0.05)。

图6 NR5a2基因在中华鳖胚胎不同发育时期的相对表达量(孵化温度：31.5 ℃)Fig.6 The relative expression of NR5a2 gene at different developmental stages of P.sinensis embryo( incubation temperature :31.5 ℃)不同小写字母表示NR5a2基因在不同发育时期的差异显著性(P<0.05)。

3 讨论

本实验通过RACE方法克隆得到中华鳖NR5a2基因cDNA序列全长，共2 674 bp，其ORF框长度为1 608 bp，编码535个氨基酸，具有一个ZnF-C4结构域和一个HOLI结构域，这与二花脸猪[13](Erhualianpig)、黄颡鱼[14](Pelteobagrusfulvidraco)等物种中的研究结果类似。系统进化树分析表明中华鳖NR5a2编码氨基酸序列与西部锦龟、鸡、扬子鳄等物种具有较高的相似性，亲缘关系较近，和斑马鱼(Daniorerio)、青鳉(Oryziaslatipes)、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)等物种的相似性较低，亲缘关系较远，这一结果与中华鳖在不同物种中的分类地位表现一致。

NR5a2是核受体超家族中的重要一员，在生长发育、细胞分化等方面发挥重要的作用，研究发现该基因主要在肝胰脏以及卵巢组织中表达。NR5a2可与7-α-羟化酶基因启动子区特异性结合并激活其转录，平衡动物体内胆汁酸水平[15]。Falender等[16]在啮齿动物卵巢研究表明NR5a2可以调节雌激素的合成。Duggavathi等[17]敲除小鼠颗粒细胞NR5a2后发现卵巢中雌激素含量降低，排卵量减少。姚勇等[13]研究指出NR5a2在二花脸猪卵巢组织中高表达，可能促进卵泡的形成和排卵，参与生殖活动。本实验通过荧光定量PCR技术检测NR5a2在中华鳖不同组织中的表达情况，结果显示，NR5a2在各组织中均有表达，在肝脏组织和卵巢组织中表达量较高，这表明NR5a2可能在中华鳖生殖功能和肝功能调控中有重要作用。

性别分化是水产动物研究热点之一，Cyp19a1a是雌激素合成的关键基因，对动物的性别分化与发育，尤其是卵巢的分化和功能维持有重要作用。在虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[4]、赤点石斑鱼[18]等研究中，NR5a2可作为转录因子与Cyp19a1a启动子结合，调控Cyp19a1a转录表达从而调节雌激素水平。在牙鲆[19]中，NR0b1和NR5a2可通过调控Cyp19a1a的表达间接调节E2水平，参与牙鲆性腺分化。此外，Yan等[20]在河豚(Tetraodontidae)性别分化关键时期检测到NR5a2高表达。王莉等[11]、葛楚天等[11]研究表明，中华鳖性腺分化时间为胚胎发育17期。本实验通过qRT-PCR检测NR5a2在中华鳖胚胎不同发育时期的表达情况。结果表明，NR5a2在胚胎发育16期(性腺分化之前)已表达，在 17期(性腺分化初期)表达水平最高，随后表达水平下降。Cyp19a1在胚胎发育17期开始显著增加[12]，推测NR5a2可能作为转录因子参与调控Cyp19a1表达，从而参与中华鳖性腺分化调控。