白芍提取物对罗非鱼氧化损伤的保护作用

李 尧，贾 睿，杜金梁，曹丽萍，顾郑琰，钱 皓，郑 涛，Galina Jeney，徐 跑,，殷国俊,

(1.南京农业大学无锡渔业学院，江苏无锡 214081；2.中国水产科学院淡水渔业研究中心，农村农业部淡水渔业种质资源利用重点实验室，江苏无锡 214081；3.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，鱼类免疫药理国际联合实验室，江苏无锡 214081；4.National Agricultural Research Center,Research Institute for Fisheries and Aquaculture,Anna Light 8,Szarvas 5440,Hungary)

集约化养殖条件下，鱼类不可避免地受到多种应激因子的刺激，会产生大量的活性氧自由基(ROS)引起氧化应激反应[1]。氧化应激状态下，过多的ROS可攻击生物膜、蛋白质和DNA，造成机体组织损伤，进而影响鱼类正常的生理和行为活动[2]。过氧化氢(H2O2)为典型的ROS之一，可直接氧化细胞膜上的脂质和蛋白质，引起氧化损伤，甚至导致细胞死亡。 因此常用于构建氧化应激或氧化损伤模型[3]。在哺乳动物中，由H2O2损伤的肝脏和肝细胞模型通常用于筛选肝脏保护剂[4]。在鱼类中也已报道H2O2可诱导草鱼卵巢细胞损伤[5]。

中草药在我国历史悠久，被广泛用于水产动物的健康养殖和疾病防治中[6-7]。中草药制剂在草鱼、团头鲂等的炎症防治、免疫力增强方面具有显著作用[8]。研究发现一些中草药对氧化应激诱导的鱼类肝损伤具有治疗作用[9]。白芍提取物(PARE，paeoniae alba radix extract)是从植物芍药根中提取的天然化合物,其主要活性成分为芍药苷、羟基芍药苷、芍药花苷、芍药内酯苷和苯甲酞等[10]，具有抑制活性氧自由基形成、清除多余自由基、减轻氧化损伤诱导的肝损伤等作用[11-12]。在水产动物中，陈锡强等[13]研究发现白芍提取物能够抑制转基因斑马鱼节间血管生长，提高免疫能力和具有抗肿瘤作用；王庆奎等[14]发现白芍提取物能够增强斑点叉尾鮰血液白细胞吞噬能力，对血液生化指标具有积极作用。但是关于白芍提取物对鱼类肝损伤保护和抗氧化性能方面的研究还未见报道。

本实验在饲料中添加白芍提取物，通过检测肝、鳃、肌肉和血清中生化指标的变化来评估其对罗非鱼(Oreochromisniloticus)抗氧化能力的影响；并用H2O2诱导罗非鱼肝损伤，测定其血清和肝组织中生化指标和基因表达的变化，评估白芍提取物对肝损伤和炎症反应的保护作用，为鱼类保肝药物的开发提供一些理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验用鱼

实验罗非鱼由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心养殖基地提供。实验正式开始前，实验鱼被暂养于循环水养殖系统中(水温(30±2)℃，pH 6.8～7.6，溶解氧> 6 mg/L，每天10%的水交换量)；并以2%体重的基础饲料饲喂，一天两次(8∶30、15∶30)。基础饲料配方见表1[15]。

表1 基础饲料组成及营养水平

注：每公斤饲料含维生素：VA 10 mg，VB150 mg，VB2200 mg，VB3500 mg，VB650 mg，VB75 mg，VB11 15 mg，VB120.1 mg，VC 1 000 mg，VD 0.05 mg，VE 400 mg，VK 40 mg,肌醇2 000 mg，胆碱5 000 mg。

每公斤饲料含矿物质：FeSO4·7H2O 372 mg，CuSO4·5H2O 25 mg，ZnSO4·7H2O 120 mg，MnSO4·H2O 5 mg，MgSO42 475 mg，NaCl 1 875 mg，KH2PO41 000 mg，Ca(H2PO4)22 500 mg。

1.2 药品、试剂及仪器

白芍提取物(白芍苷10%)购于西安汇林生物科技有限公司(陕西西安)；实验所用的麻醉剂和H2O2试剂购自南京凯基生物技术有限公司(江苏南京)，磷酸盐缓冲液从Sigma Company(St.Louis，MO，USA)订购；总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)等试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 实验设计与养殖

将健康的罗非鱼随机分为5组，空白对照组(不添加药物，不注射H2O2)、H2O2组(不添加药物，注射H2O2)和白芍提取物组(0.5、1、5 g/kg，注射H2O2)，每组设置3个重复，每缸15尾鱼。空白对照组和H2O2组投喂基础日粮，白芍提取物组分别投喂含0.5、1、5 g/kg白芍提取物的日粮。饲养60 d后，对所有鱼进行称重，并从空白对照组和白芍提取物组(0.5、1、5 g/kg)分别随机选取15条罗非鱼置于0.05% MS-222水溶液中(三甲基甲磺酸盐，Sigma，MO，USA)麻醉，采集血液、肝、鳃和肌肉组织检测SOD、 GSH、T-AOC和MDA，评估白芍提取物对罗非鱼抗氧化能力的影响。

氧化损伤实验：投喂60 d后，每组随机挑选15条罗非鱼进行氧化损伤实验。空白对照组腹腔注射生理盐水，H2O2组和白芍提取物组腹腔注射300 mmol/L H2O2。24 h后，将实验鱼置于0.05% MS-222水溶液中麻醉，并立即采集血液和肝组织，检测血清GPT、 GOT、 TP和Alb等生化指标，肝匀浆SOD、GSH、T-AOC和MDA等生化指标和TNF-α、IL-1β、IL-8和IL-10的基因表达，评估白芍提取物对罗非鱼肝损伤和炎症反应的保护作用。

1.4 生化指标检测

按照试剂盒说明书，用相应的试剂盒分别测定血清生化指标GPT、GOT、TP、Alb、SOD、GSH、T-AOC和MDA；肝、鳃和肌肉组织匀浆生化指标SOD、GSH、T-AOC和MDA。

1.5 实时荧光定量PCR检测

取适量的肝组织加入RNAiso Plus(Takara，大连)提取总RNA。通过Gene Quant1300紫外可见分光光度计(GE Healthcare Biosciences公司)测定RNA的浓度和纯度，然后通过反转录试剂盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa)合成cDNA。

使用实时荧光定量PCR技术检测TNF-α、IL-1β、IL-8和IL-10的基因表达量。PCR反应根据TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(TaKaRa)试剂盒说明书。反应条件为：预变性 95 ℃ 、10 s；40个循环 95 ℃、5 s，60 ℃、 1 min。内参引物和特异性引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。引物序列见表2，β-actin基因作为内参基因，用2-△△Ct方法分析基因相对表达量。

表2 qRT-PCR引物

1.6 计算公式

特定生长率(SGR)= [ lnWt-lnW0]/t×100%;

饲料系数(FCR)= FI/(Wt-W0)

式中，W0为鱼初体均重(g)；Wt为鱼末体均重(g)；t为饲喂天数(d)；FI为每尾鱼平均摄食饲料总量(风干样重)(g)。

1.7 数据分析

使用SPSS 20.0软件包进行数据分析，所有数值均以均值±标准误表示。所有数据通过单因素方差进行(ANOVA)统计学分析，并对不同组间数据进行 Tukey 多重比较，P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 白芍提取物对罗非鱼生长的影响

表3数据显示，罗非鱼投喂含白芍提取物的饲料60 d后，特定生长率略高于对照组，饵料系数略低于对照组，但均无显著性差异。

表3 白芍提取物对罗非鱼生长的影响

2.2 白芍提取物对罗非鱼肝、鳃、肌肉和血清抗氧化能力和脂质过氧化的影响

表4所示，在肝组织中，与对照组相比， 1和5 g/kg白芍提取物显著提高了SOD活力、促进了GSH和T-AOC的形成、降低了MDA含量 。鳃组织中，SOD、GSH和 T-AOC水平在 5 g/kg白芍提取物组中被显著提高，同时MDA形成被显著抑制。肌肉组织中，三种不同浓度白芍提取物对抗氧化能力和脂质过氧化水平没有显著影响。血清中，与对照组相比，5 g/kg白芍提取物显著提高了SOD酶活性和T-AOC水平，同时1 g/kg 白芍提取物也提高了T-AOC水平。

表4 注射H2O2前白芍提取物对罗非鱼肝、鳃、肌肉和血清SOD、GSH、T-AOC和 MDA的影响

注：同一行数值右上角标有不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.3 白芍提取物对H2O2损伤后罗非鱼血清GPT和GOT活性的影响

如图1所示， H2O2损伤后GPT和GOT活性极显著升高，而三种不同浓度白芍提取物的饲料预处理后，GPT和GOT活力均极显著下降。

图1 白芍提取物对H2O2处理后罗非鱼血清GPT和GOT活性的影响Fig.1 Effects of PARE on serum GPT and GOT after H2O2 injection0.5 group示0.5 g/kg白芍提取物组；1 group示1 g/kg白芍提取物组；1.5 group示1.5 g/kg白芍提取物组不同字母表示组间具有差异显著P<0.05，下同

2.4 白芍提取物对H2O2损伤后罗非鱼血清TP和Alb含量的影响

由图2可知，与空白对照组相比，H2O2组中TP和Alb含量显著降低，而三种不同浓度白芍提取物的饲料预处理后，血清TP含量降低被显著抑制；同样，5 g/kg白芍提取物预处理后，血清Alb水平也呈现了类似的变化。

2.5 白芍提取物对H2O2损伤后罗非鱼肝脏SOD、 GSH、T-AOC和 MDA的影响

通过测定肝组织匀浆中的SOD、GSH、T-AOC和MDA来评估白芍提取物的抗氧化能力和对罗非鱼肝损伤的保护作用。如图3所示， H2O2处理24 h后，SOD、 GSH和T-AOC水平显著下降，而MDA含量显著升高。与H2O2组相比，1 g/kg白芍提取物预处理后， SOD水平和GSH含量显著升高；同时1和5 g/kg白芍提取物也显著提高了T-AOC水平；与此相反，三种不同浓度的白芍提取物预处理显著抑制了MDA形成。

2.6 白芍提取物对H2O2损伤后罗非鱼肝TNF-α、 IL-1β、 IL-8 和IL-10基因表达的影响

如图4所示，与对照组相比，H2O2损伤引起了TNF-α、IL-1β和IL-8基因显著上调，以及IL-10基因显著下调。与H2O2组相比，三种不同浓度的白芍提取物显著抑制了TNF-α、IL-1β和IL-8基因的上调，同时IL-10基因的下调在0.5和1 g/kg白芍提取物作用也被显著抑制。

图2 白芍提取物对H2O2处理后罗非鱼血清TP和Alb的影响Fig.2 Effects of PARE on serum TP and Alb after H2O2 injection

图3 白芍提取物对H2O2处理后罗非鱼肝脏SOD、GSH、T-AOC和 MDA的影响Fig.3 Effects of PARE on liver SOD,GSH,T-AOC and MDA after H2O2 injection

图4 白芍提取物对H2O2处理后罗非鱼肝TNF-α、IL-1β、IL-8 和 IL-10基因表达的影响Fig.4 The changes of TNF-α,IL-1β,IL-8 and IL-10 mRNA levels in liver of tilapia treated with H2O2

3 讨论

与哺乳动物类似，鱼类也具有抗氧化系统，主要由抗氧化酶(如SOD等)和非酶抗氧化物质(如GSH等)，在抵御氧化应激、清除多余自由基和维持机体氧化还原状态的动态平衡中起重要作用。同时，抗氧化系统与机体免疫力密切相关，其各成分的活性或含量的变化与多种疾病相关。已有研究表明氧化应激以及抗氧化能力的降低与肝损伤的发生密切相关[16]。

H2O2为常见的氧化剂，广泛用于诱导多种细胞和动物建立氧化应激模型[17-18]。在肝细胞中，H2O2处理可能导致细胞膜脂质过氧化和蛋白质氧化，破坏细胞膜结构和功能，并伴随着细胞质酶GPT和GOT的渗漏[19-21]，因此， GPT和GOT为经典的肝损伤评价指标。本研究中，H2O2处理后，血清中GPT和GOT的酶活性显著增加，表明氧化应激引起严重的肝损伤。而白芍提取物处理组中GPT和GOT活性显著降低，同时TP和Alb 含量的显著降低，表明白芍提取物对H2O2诱导的肝损伤具有保护作用，同时抑制肝组织中蛋白损伤。有研究者推测这种保护机制与其抗磷脂氧化作用有关[22]。在哺乳动物中的研究发现白芍提取物能够有效地抗脂质氧化，抑制了GPT和GOT从肝细胞释放到血液中，保护细胞膜的完整性，本实验结果和在小鼠的研究结果一致[11]。

研究发现多种药物的抗氧化能力在肝保护中起着主要作用[22]。哺乳动物中的研究表明，白芍提取物能够显著提高SOD活性和T-AOC的含量，缓解自由基对细胞结构的损伤[22]。本研究结果显示，白芍提取物可有效提高血清、肝和鳃中SOD、T-AOC和GSH水平，表明白芍提取物可提高罗非鱼抗氧化能力。同时本研究结果还显示，白芍提取物预处理可不同程度地抑制了SOD、GSH和T-AOC水平的下降，这表明白芍提取物能促进罗非鱼肝组织中抗氧化酶活力和抗氧化物质的形成，进而清除多余的自由基，抑制氧化应激引起的肝损伤。

脂质过氧化是肝损伤的重要指标之一，MDA是脂质过氧化物的分解产物，其水平的升高可以反映肝脏脂质过氧化损伤程度[23]。秦亚东等研究结果显示，白芍提取物可抑制MDA的上升，阻止脂质过氧化引起的肝细胞损伤[22]。本实验结果显示，H2O2可显著增加罗非鱼肝组织MDA的含量，促使肝细胞脂质过氧化，加剧罗非鱼肝损伤；而不同水平的白芍提取物处理后MDA的生成显著被抑制。表明白芍提取物可以抑制H2O2引起的罗非鱼肝组织中脂质过氧化的产生，改善氧化应激，保护罗非鱼肝组织细胞膜的结构与功能不受过氧化物的损害。这与在小鼠和其他哺乳动物中的研究结果一致[12]。

研究表明炎症反应为肝损伤发生的主要症状之一。TNF-α、IL-1β和IL-8是鱼类炎症反应中关键的细胞因子，在肝损伤中起着重要的作用[24]。H2O2诱导的肝损伤发生时，肝脏Kupffer细胞会分泌促炎性因子如TNF-α、IL-1β和IL-8等[25]，同时启动炎症信号通路加重炎症反应，并诱发肝损伤和纤维化[26]。本实验结果也表明，H2O2损伤显著促进了TNF-α、IL-1β和IL-8基因表达的上调，表明氧化应激诱导炎症反应。而用0.5、1和5 g/kg白芍提取物的饲料饲喂后，罗非鱼肝组织中TNF-α、IL-1β和IL-8基因水平均显著降低，这表明白芍提取物具有抗炎作用，可显著缓解罗非鱼肝组织炎症反应，抑制肝损伤发生。

IL-10为炎症反应过程中最主要的负调节细胞因子，具有广泛的抑制炎症活性作用[23]。IL-10能够抑制TNF-α产生，调节肝细胞增殖，在肝损伤中发挥着极其重要的保护作用[24]。在小鼠中的研究表明，内源性IL-10通过减轻炎症反应而影响肝细胞坏死，修复肝损伤[27]。本试验结果显示，H2O2可显著降低罗非鱼肝组织IL-10的基因表达量，促使肝细胞损伤；而白芍提取物(0.5和1 g/kg)处理后IL-10的基因表达量均显著上升。表明白芍提取物可促进IL-10表达，抑制氧化应激引起的炎症反应，进而有效保护肝损伤，本研究结果与在小鼠和其他哺乳动物中的研究结果一致[28]。以上结果也表明白芍提取物保肝作用与其抗炎性作用相关。