响应面法优化南极磷虾蛋白酶解工艺条件

张华丹，张玲云，张国玉，梁鹏*

1. 福建农林大学食品科学学院（福州 350002）；2. 辽渔南极磷虾科技发展有限公司（大连 116113）

南极磷虾（Antarctic krill）是一类生活在南大洋南极水域的磷虾，以数亿吨之巨的总量成为了南极大多数生物的食物来源[1]。据估计，南极磷虾的可捕捞量每年超过1 000万 t。由于世界人口的增加，粮食的短缺，南极磷虾很可能成为世界上最后的海洋资源[2]。

南极磷虾是一种高营养价值的水产品，因而具有广阔的应用前景。南极磷虾中蛋白含量丰富，必需氨基酸比例合适，是人类理想的高级营养食物[3]，作为一种宝贵的富含ω-3脂肪酸和蛋白质的可持续资源，南极磷虾可加工成供人类食用的磷虾粉[4]。目前，南极磷虾粉是南极磷虾资源开发利用的主要产品，将南极磷虾粉及其水解产物作为原料，应用于色素、鱼和蔬菜蛋白质、诱食剂等产品中具有很大的市场前景[5]。近年来，国内外研究人员已经对南极磷虾粉的营养价值及组成成分展开了大量的研究。结果表明南极磷虾粉中平均蛋白质含量达到60%，且含有丰富的脂肪酸[5]，说明南极磷虾粉具备较大的开发利用前景。

为进一步开发利用南极磷虾蛋白粉资源，试验率先通过酶法水解南极磷虾粉拟获得多肽，以期提高其食用营养价值。另外，还可为其水解产物制备成天然鱼酱油、食源肽提供优质原料，降低生产成本[6]。然而，目前有关南极磷虾蛋白粉酶解工艺方面的研究报道还较鲜见。因此，研究拟在比较中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶及碱性蛋白酶酶解效果的基础上，选择最优酶对南极磷虾蛋白粉进行酶解，并采用响应面法来获得酶解南极磷虾粉的最优工艺。研究结果可为南极磷虾粉的深加工提供理论依据，对拓展南极磷虾蛋白的应用具有重要指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南极磷虾粉：由辽渔南极磷虾科技发展有限公司馈赠；木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶均购自北京索莱宝科技有限公司；氢氧化钠、甲醛等化学试剂（AR），均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

恒温磁力加热搅拌器（HJ-4 A），江苏金坛市宏华仪器厂；实验室pH计（ST 2100），奥豪斯仪器（常州）有限公司；数显式电热恒温水浴锅（XMTD-204），上海博迅实业有限公司医疗设备厂；台式高速冷冻离心机（TGL-20 M），湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；自动凯氏定氮仪（K 9840），济南海能仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解流程

称取南极磷虾粉10 g，按以下流程进行酶解[7-8]：

南极磷虾粉样品→加入磷酸盐缓冲溶液→调节至酶的最适温度和pH→加入蛋白酶→酶解一定时间→95℃灭酶15 min→冷却至室温→4 ℃下8 000 r/min离心15 min→过滤→获得酶解液

1.3.2 水解度（DH）计算

1) 蛋白质水解度是指蛋白质在酶解过程中肽键被断裂的程度，即酶解液中游离氨基酸态氮总含量与总氮含量的比值[9]，计算公式如式（1）所示：

2) 总氮质量分数测定采用国标中凯氏定氮法[10]，计算公式如式（2）所示：

式中：X1为总氮质量分数，g/100 g；V1为试液消耗盐酸标准滴定液的体积，mL；V2为试剂空白消耗盐酸标准滴定液的体积，mL；V3为吸取消化液的体积，mL；m为试样的质量，g；c为盐酸标准滴定溶液浓度，mol/L。

3) 酶解液游离氮含量的测定采用甲醛滴定法：参考文献[9]，并略有改进。取离心过滤后的酶解液10 mL定容于100 mL容量瓶中，吸取10.0 mL稀释液，置于200 mL烧杯中，加60 mL水，充分混合摇匀，用氢氧化钠标准溶液[c（NaOH）=0.050 mol/L]滴定至pH计指示pH为8.2，记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数，再加入10.0 mL甲醛溶液，混匀。用氢氧化钠标准滴定溶液继续滴定至pH为9.2，记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数。同时用蒸馏水代替酶解液做空白对照，记下所消耗的标准氢氧化钠溶液的体积。计算公式如式（3）所示：

式中：X2为试样中游离氨基酸态氮的含量，g/100 mL；V1为试样稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；V2为试剂空白加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；c为氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，mol/L；V为吸取试样的体积，mL；V3为试样稀释液的取用量，mL；V4为试样稀释液的定容体积，mL。

1.3.3 最优酶及最适料液比选取

将南极磷虾粉与磷酸盐缓冲溶液按一定比例配成样品溶液后，调节至各酶的最适温度和pH，分别加入酶量为0.4%的中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶。酶解结束后，测定其酶解液水解度，比较这四种酶的水解效果，确定最优酶进行后续试验。

试验表明，最优酶为碱性蛋白酶。因此在后续研究过程中采用碱性蛋白酶进行试验。碱性蛋白酶最适pH值为8.0，最适酶解温度为50 ℃，在最适pH和温度下，添加0.4%的酶，酶解时间4 h，此条件下，以料液比1:10，1:20，1:30，1:40和1:50（g/mL）进行三次平行试验。结果表明，当料液比为1:30（g/mL）时酶解液水解度最高，因此以料液比为1:30（g/mL）开展单因素试验。

1.3.4 单因素试验

初始pH的选择：采用不同pH的磷酸盐缓冲溶液，并用氢氧化钠溶液调节至酶解初始pH分别为7.5，8，8.5，9和9.5，酶添加量为0.4%，50 ℃下酶解4 h后灭酶离心过滤得酶解液，测定其水解度，确定最佳酶解初始pH。酶解温度的选择：在酶解温度分别为40，45，50，55和60 ℃时，酶添加量为0.4%，在最佳pH条件下酶解4 h测定其酶解液的水解度，以确定最佳的酶解温度。酶添加量的选择：测定酶添加量分别为0.4%，0.8%，1.2%，1.6%和2.0%，于最佳酶解pH和温度时酶解4 h条件下测定其酶解液水解度，确定最佳的酶添加量。酶解时间的选择：在最佳酶解pH、温度和酶添加量时，测定酶解时间分别为2，3，4，5和6 h的酶解液水解度，确定最佳酶解时间。

1.3.5 响应面设计

在单因素试验的基础上，以水解度为响应值，开展四因素三水平响应面试验，以确定南极磷虾蛋白粉酶解的最佳工艺条件。

2 结果与分析

2.1 最优酶及最适料液比的选择

具有不同构象的蛋白酶，针对同种底物其作用位点不同，产生一定差异的功能特性因而具有不同的反应活力[11]。从图1中可以看出，木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶这四种酶酶解南极磷虾蛋白的水解效果差异明显。其中木瓜蛋白酶、中性蛋白酶在四种蛋白酶中水解度较低，胰蛋白酶水解度较高，而碱性蛋白酶的水解效果最好，水解度达到12.19%。因此确定碱性蛋白酶作为试验用酶。在碱性蛋白酶最适酶解温度50 ℃，酶解pH为8.0时，酶添加量为0.4%，酶解4 h进行最适料液比的试验。试验结果如图2，从中可以看出，在料液比为1:30（g/mL）时其水解效果最好，水解度达到11.60%。当底物浓度较低时，酶与底物不能很好地结合，水解度随着浓度的降低而不断降低；在高浓度时，底物的流动性变差，酶跟底物不能充分接触，且加水量少造成其低水分活度，抑制了推动其反应所需的自由能，导致水解度下降[12]，根据试验结果来看，确定料液比为1:30（g/mL）进行后续的单因素试验

图1 几种酶对南极磷虾蛋白粉的水解效果

图2 料液比对南极磷虾蛋白粉水解度的影响

从图3可以看出，随着酶解体系pH的升高，水解度也随之增大，当pH为8时，水解度达到最大，随着pH的继续增大，水解度开始下降。碱性蛋白酶的最适pH为8，低于或者高于这一pH条件时，其蛋白酶活力会下降导致酶解能力减弱水解度降低。

图3 pH对南极磷虾蛋白粉水解度的影响

从图4可以看出，随着酶解温度的不断升高，水解度呈现先增大后减小的趋势，在温度为45 ℃时水解效果最好，水解度达到13.45%。这是由于随着温度的升高，酶活力也在逐渐变大，酶促反应加快，但当超过最适温度，酶活力开始变小。因此试验采取45 ℃左右为酶解的最适温度。

图4 温度对南极磷虾蛋白粉水解度的影响

从图5可以看出，在酶添加量为0.4%～1.2%时，水解度增加趋势平缓；在酶添加量为1.2%～1.6%时水解度显著增加；在酶添加量为1.6%～2.0%时，水解度几乎保持不变，这是由于底物逐渐被消耗，酶趋于饱和状态，综合水解效果和工艺成本的考虑，选取酶添加量为1.6%进行后续试验。

图5 酶添加量对南极磷虾蛋白粉水解度的影响

从图6可以看出，随着酶解时间的延长，水解度不断增加，但当酶解时间超过5 h以后，水解度开始下降。这可能是因为随着酶解时间的延长，酶活力下降部分酶的失活，而且过度水解导致氨基酸被破环，游离氨基氮含量减少从而导致水解度降低[13]。因此确定酶解时间为5 h比较适宜。

图6 酶解时间对南极磷虾蛋白粉水解度的影响

2.2 响应面中心组合试验及结果

根据单因素试验结果，采用Box-Behnken设计原理，取pH、酶添加量、温度和时间为影响因素，以水解度为响应值，进行四因素三水平响应面试验，因素水平设置见表1，结果见表2。

根据表2的结果，利用Design-Expert 8.0.6.1软件对表2进行多元回归分析，得到回归方程：DH=+15.06+0.34A+0.71B+0.34C-0.086D-0.10AB-0.065AC+0.20AD-0.15BC+0.60BD-0.32CD-1.14A2-0.82B2-0.59C2-0.51D2。

表1 Box-Behnken试验设计因素水平及编码

表2 Box-Behnken试验设计及结果

对试验所建立的回归模型进行方差分析，结果如表3所示。由表3方差分析可知，模型极显著（p=0.009 5＜0.01），失拟项不显著（p=0.098 2＞0.05），试验无失拟因素存在，说明该模型与实际拟合程度好。变异系数C.V.=4.76%，变异系数较低，说明试验的可信度与精密度较高，此次试验精密度为6.571＞4，在精密度试验模型中该模型精密度良好。在此试验设计中，B、A2、B2项均为极显著（p＜0.01），C2项影响显著。由表3中F值可以看出，各因素对南极磷虾蛋白酶解液水解度的影响程度依次是：酶解时间＞酶添加量＞酶解温度＞初始pH。交互项对酶解效果影响不是很突出。

表3 二次回归模型及方差分析

各因素之间的交互作用响应面图如图7～图12。响应面图是响应值对各因素之间所构成的三维图，因素对响应值的影响程度大小决定了曲线的陡峭程度[14]。由图7，图9和图11可以看出，温度和时间、温度和pH、pH和时间这三组的两两交互作用对水解效果影响较显著。由图8和图12可以看出，在较低的温度和较低pH的情况下，碱性蛋白酶的活性较低，通过酶量的增加可以提高酶的水解能力，这与单因素的试验结果一致。

图8 温度和酶添加量交互作用对水解度的影响

图9 温度和pH交互作用对水解度的影响

图10 酶添加量和时间交互作用对水解度的影响

图11 pH和时间交互作用对水解度的影响

图12 酶添加量和pH交互作用对水解度的影响

2.3 最佳酶解方案验证

应用响应面分析法优化酶解工艺，经曲面拟合后，得到的最佳酶解条件为：酶解温度为45.68 ℃、酶添加量1.67%、酶解时间5.47 h、pH为8.08。在此条件下预测的水解度达到15.27%。为了检测模型预测的可靠性，验证试验过程中采取酶解温度46 ℃、酶添加量1.7%、酶解时间5.5 h、初始pH为8.08，进行三次预测试验，测得的水解度平均值为15.41%与理论值预测值15.27%误差较小，说明该响应面模型可靠。

3 讨论与结论

试验通过响应面试验设计优化南极磷虾蛋白的酶解工艺，采用了Box-Behnken试验设计原理与响应面分析，建立了酶解工艺的二次多项式数学模型。通过对模型的响应面分析，了解各因素及其交互作用对南极磷虾蛋白水解度的影响[15]。其中时间是影响南极磷虾粉酶解的关键因素。从响应曲面图可以看出来，温度和时间、温度和pH、pH和时间，这三组交互作用明显，其他因素之间的交互作用不太明显。最后，对二次模型的分析获得了酶解南极磷虾蛋白的最佳工艺条件，即酶解温度为45.68 ℃、酶添加量1.67%、酶解时间5.47 h、pH为8.08，在此条件下，水解度可达15.27%。经验证试验可知，该模型能很好地预测南极磷虾蛋白的水解度。