龙眼酒酿造过程中有机酸变化的分析

邓红梅，柳镜炬，邓晓琳，温兆毅，李乐珠

广东省岭南特色果蔬加工及应用工程技术研究中心，广东普通高校食品科学创新团队，广东高校果蔬加工与贮藏工程技术开发中心，广东石油化工学院生物与食品工程学院（茂名 525000）

龙眼是茂名等岒南地区的特色水果，每年的6-8月是龙眼的成熟季节，但由于龙眼鲜果不耐储运，而且龙眼的保鲜方法尚未有突破，导致产量增加而收入却未增加，挫伤了果农的生产积极性，所以很有必要对新鲜龙眼进行深加工。目前，市面上龙眼制品主要包括桂圆肉、龙眼罐头、龙眼干、龙眼果酱等，品种较少。龙眼果肉含糖达到20%左右，且营养丰富，因此龙眼是酿造果酒的优质原料[1]。

现代医学研究表明，龙眼酒具有明显的抗癌、抗衰老的作用，以及促进智力发育、加强免疫调节等功效[2]。龙眼酒具有一定保健作用，它能够补益心脾、壮阳益气、润肤美容、养血安神，还可以治疗心悸、贫血、健忘、失眠、身体虚弱及神经衰弱等症状[3]。果酒中酸性物质是主要呈味物质之一，有机酸的含量对于果酒的稳定性、品质、风味等方面有着很大影响。龙眼酒发酵过程中有机酸的成分和含量的变化规律研究仍鲜见报道，试验利用高效液相色谱法研究初始糖度对龙眼酒发酵过程中有机酸的动态变化规律，希望能为龙眼酒酿造工业化发展提供一些参考。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

龙眼（品种：石硖），茂名市市售；酒用高活性干酵母，安琪酵母股分有限公司。

果胶酶、蔗糖、磷酸二氢钾、偏重亚硫酸钾，为食品级；酒石酸、草酸、α-酮戊二酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、草酰乙酸、乳酸为标准品；甲醇为色谱纯。

BSP-250恒温培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；LC 20 AT高效液相色谱仪，日本岛津公司；BCD-246 WTM（E）美的冰箱，合肥美的电冰箱有限公司；80-2电动离心机、HH-4数显恒温水浴锅，常州澳华仪器有限公司；WZ系列手持折光糖度计，上海聚亮光学仪器有限公司；JA 1003电子分析天平，上海上天精密仪器有限公司；RHWN-25 OeATC手持折光酒度计，漳州市新奥光电仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 龙眼酒酿造工艺流程

龙眼→分选→清洗→去壳去核→搅碎→加果胶酶酶解→过滤除渣→成分调节→加活化后的果酒酵母→前发酵→澄清、换罐→后发酵→成品→检测

1.2.2 操作要点

1) 挑选新鲜完整的龙眼，去壳去核获得石峡果肉2 500 g，添加1.25 g偏重亚硫酸钾，防止果肉氧化。

2) 进行搅碎，搅碎时按果肉与超纯水质量比3:1加入800 mL超纯水；按果肉与柠檬酸质量比5 000:1加入0.5 g柠檬酸；按果肉与果胶酶质量比1 250:1加入2.0 g果胶酶，处理3 h，搅碎完成后，将果汁过滤后装入发酵罐中。

3) 添加蔗糖调整初始糖度为20%，22%，24%，26%和28% 5个糖度梯度，并设置2个平行组进行试验研究。按果肉与酵母质量比50 000:7加入0.35 g活化酵母菌，在20 ℃下进行低温发酵。7 d后过滤除渣、换罐、封闭进行后发酵及陈酿。

4) 分别在发酵前取果汁；第7天龙眼酒的主发酵基本完成时取酒样；第14，第21，第28以及第35天龙眼酒发酵完成时取酒样，用于测定8种有机酸的含量。

1.2.3 龙眼酒中有机酸含量的测定

样品处理：直接进样法，分别用移液管移取2 mL果汁、酒样至离心管中，以4 000 r/min转速离心分离15 min，取上清液过0.22 μm膜后转入干净进样瓶，待测。

色谱条件：采取等梯度洗脱模式[4]，Thermo ODS色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相，0.02 mol/L KH2PO4（pH 2.8）97%-甲醇3%；柱温，30 ℃；流速，1.0 mL/min；检测波长，210 nm；进样量，10 μL；单次检测12 min。

2 结果与分析

2.1 8种有机酸标准曲线及色谱图

在1.2.3小节中的色谱条件下，测得8种有机酸标准溶液峰面积，以不同浓度的有机酸为横坐标，峰面积为纵坐标，作出标准曲线，得出线性回归方程和相关系数R2，结果见表1。

2.2 不同初始糖度酿造龙眼酒过程中有机酸含量的变化规律

以有机酸含量为纵坐标，发酵时间（果汁定为0）为横坐标，用Origin Pro 8软件作出龙眼酒发酵过程有机酸含量的变化图（图1～图5）。由图1～图5可见，在不同初始糖度条件下，龙眼酒发酵过程中8种有机酸的变化有相似性。在发酵的前7 d，除了酒石酸含量呈明显减少外，乳酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸和草酰乙酸含量均明显增加。草酸和α-酮戊二酸则无明显变化。除乳酸外，其余7种有机酸在21 d后基本保持平稳。

表1 8种有机酸的标准曲线的回归方程以及相关系数

图1 20%糖度龙眼酒发酵过程有机酸含量变化

图3 24%糖度龙眼酒发酵过程有机酸含量变化

图4 26%糖度龙眼酒发酵过程有机酸含量变化

图5 28%糖度龙眼酒发酵过程有机酸含量变化

表2 各糖度发酵的果酒完成发酵时与果汁中有机酸的比较

经过35 d的发酵与陈酿，龙眼果酒中8种有机酸与龙眼果汁中的有机酸比较可得出变化规律，结果见表2。

由表2可见，35 d后的龙眼酒中草酸、酒石酸的最终含量均比果汁中的含量低，初始糖度越大，龙眼酒中含量越低。而草酰乙酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸的最终含量比果汁有较明显升高；α-酮戊二酸和苹果酸则无明显的变化规律。

对于同一种有机酸来说，不同初始糖度对其影响规律也基本一致，初始糖度越高对应的有机酸含量就越少，其中主要的原因是糖度太高会致使酵母生长过于旺盛而抑制了发酵[5]。

试验研究了20%，22%，24%，26%和28% 5个梯度的初始糖度，在20 ℃下低温发酵酿造龙眼酒，通过对龙眼酒色泽、香气、酒体和风味进行评价，一致认为初始糖度为22%～24%发酵产生的龙眼酒品质最佳。

2.3 24%初始糖度下发酵过程中有机酸含量动态变化规律

在24%初始糖度下，龙眼酒不同发酵时间有机酸含量变化的色谱图如图7～图11所示。8种有机酸标准色谱图见图6。

在24%初始糖度条件下不同发酵时间龙眼酒有机酸含量变化见表3。

由表3可以看出，原果汁中均含有8种有机酸，在发酵过程中8种有机酸各自发生着不同的变化。不同发酵时期8种有机酸的总和均比原果汁的高，表明发酵过程中的有机酸的增加是与发酵同步的，它们除给果酒带来了独特的味道，还使酿造环境转变为pH较低的环境，而这环境有利于抑制一些有害的细菌生长，达到长久储存的目的。在主发酵（7 d前）过程中，草酸、酒石酸含量大幅度下降，最终有1/2以上被消耗了，主要是由于形成了相应的草酸盐和酒石酸盐[6-7]，α-酮戊二酸减少较缓慢；而草酰乙酸、苹果酸和琥珀酸的含量迅速上升，苹果酸含量的变化主要是与苹果酸-酒精发酵或者是苹果酸-乳酸发酵有关。其中苹果酸-酒精发酵是由酵母菌利用细胞内苹果酸酶将苹果酸转化为丙酮酸引起的。在酒精发酵中，因为酵母菌通常不能有效将苹果酸完全转化，所以会出现苹果酸-乳酸发酵停滞现象，苹果酸既可以被酵母代谢又可以被酵母合成[7]。在苹果酸-乳酸发酵，由乳酸菌利用细胞内苹果酸酶将苹果酸转化乳酸和CO2，酒石酸也能被乳酸菌降解生成乳酸和乙酸。由于苹果酸、酒石酸含量的减少而乳酸含量的增加，其结果使龙眼酒的口感变得更加柔顺细腻、润滑，酸度降低，从而提高果酒的质量，此发酵过程也被称为果酒降酸过程[8]。由表3还可见，柠檬酸、琥珀酸的含量在发酵的整个过程中均在上升，α-酮戊二酸含量在低糖度环境下发酵略微上升，高于22%初始糖度的均呈下降变化。α-酮戊二酸是由酵母产生的一种微量有机酸[9-10]，α-酮戊二酸的浓度变化主要可能是由微生物的代谢积累以及被消耗利用所引起的[6]。有机酸含量高低影响龙眼酒的口味、风味和色泽的平衡，最终影响龙眼酒的品质[11-12]。乳酸、柠檬酸、琥珀酸随陈酿时间延长而增加，乳酸是一种略带酸味的一元弱酸，能使果酒口感柔和、圆润；柠檬酸是有机酸中酸性较强的一种酸，具有温和的酸味；琥珀酸味道较浓，既苦又咸，能引起唾液的分泌，最具有味觉特征，可使酒的味道浓重，增加醇厚感。各种有机酸相互调和使龙眼酒产生独特的风味。

图6 8种有机酸标准色谱图

图7 24%糖度发酵第7天色谱图

图8 24%糖度发酵第14天色谱图

图9 24%糖度发酵第21天色谱图

图10 24%糖度发酵第28天色谱图

图11 24%糖度发酵第35天色谱图

表3 24%初始糖度条件下不同发酵时间8种有机酸的含量

3 结论

在不同初始糖度条件下，龙眼酒发酵过程中8种有机酸的变化有相似性。在发酵的前7 d，除了酒石酸含量明显减少外，乳酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸和草酰乙酸含量均明显增加。草酸和α-酮戊二酸则无明显变化。除乳酸外，其余7种有机酸在21 d后基本保持平稳。

在初始糖度24%条件下，龙眼酒发酵过程中8种有机酸均发生了变化，不同发酵时期8种有机酸的总和均比原果汁的高，表明发酵过程中的有机酸的增加是与发酵同步的。在发酵的前7 d过程中，草酸、酒石酸含量大幅度下降，最终有一半以上被消耗了；草酰乙酸，乳酸、苹果酸的含量在发酵的前7 d迅速上升，随后趋于平稳；α-酮戊二酸则在发酵7 d后稍有下降，而后也趋于平稳。从草酰乙酸，苹果酸以及α-酮戊二酸的含量变化可以看出，从发酵第7天后到陈酿的过程中这三种酸都是比较稳定的；柠檬酸、琥珀酸的含量在发酵的整个过程里均在上升。龙眼酒中主要的有机酸是乳酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸，其次是草酰乙酸和酒石酸，各种有机酸相互调和使龙眼酒产生独特的风味。