一测多评法同时测定养阴镇静片中8 种成分

沈静琳， 丁 莹

（1.江西医学高等专科学校药学系，江西 上饶334000；2. 广东药科大学医药化工学院，广东 中山528458）

养阴镇静片收载于《中药成方制剂制剂（第二册） 》［1］，由麦冬、地黄、茯苓、丹参等14 味药材加工而成，具有滋阴养血、镇惊安神的疗效，临床上用于心血不足、怔神健忘、心烦不安、心悸失眠等病症，方中地黄、玄参、麦冬、五味子滋阴生津润燥，为君药；附以茯苓、丹参、柏子仁、远志、首乌藤养心安神定惊，当归、党参气血调补，珍珠母、朱砂平肝潜阳，桔梗宣肺利咽，共奏补血养心、滋阴降火、镇惊安神之效。现代研究表明，养阴镇静片具有中枢抑制作用，对更年期失眠症、阴虚火旺引起的神经衰弱等病症疗效显著［2-4］，但现行质量标准未对方中任何成分进行含有量测定，文献［5］ 也仅针对了阿魏酸。

为了全面有效地控制养阴镇静片质量，确保有效性，本实验参考中药质量标志物确定原则［6-7］，根据中药制剂在中医理论指导下组方配伍的原理，结合君药为主，臣、佐、使兼顾的原则，选择主要药材麦冬、地黄、茯苓、丹参作为研究对象，以丹参酮ⅡA为内标，采用一测多评法同时测定麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、梓醇、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、丹参素、丹参酮ⅡA的含有量，为该制剂质量控制提供参考。

1 材料

Waters 2695 型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；AL204 型电子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；KQ-250E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。养阴镇静片 （每片重0.3 g， 批号20170403、20170901、20180101） 购自吉林亚泰明星制药有限公司。梓醇（110808-201711）、丹参酮ⅡA（110766-201721） 对照品购自中国食品药品检定研究院；麦冬甲基黄烷酮A（74805-92-8）、甲基麦冬二氢高异黄酮B（74805-91-7）对照品购自江苏永健医药科技有限公司；去氢土莫酸（6754-16-1）、去氢茯苓酸（77012-31-8） 对照品购自南京森贝伽生物科技有限公司；茯苓酸（29070-92-6）、丹参素（22681-72-7）对照品购自上海纯优生物科技有限公司。乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Hypersil ODS-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相乙腈（A） -0.1%磷酸（B）， 梯 度 洗 脱 （0 ～15 min， 26.0%A； 15 ～23 min，26.0%→38.0%A；23 ～31 min，38.0%→42.0%A；31 ～49 min，42.0%→77.0%A；49 ～63 min，77.0%→85.0%A；63 ～70 min，85.0%→26.0%A）；0～23 min 时在296 nm［8］波长下检测麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B，23 ～49 min 时在210 nm［9-13］波长下检测梓醇、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、 茯苓酸， 49 ～70 min 时 在280 nm［14-15］波长下检测丹参素、丹参酮ⅡA；体积流量0.8 mL／min；柱温30 ℃；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、梓醇、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、丹参素、丹参酮ⅡA对照品适量，70%甲醇制成质量浓度分别为0.212、0.196、0.978、0.534、0.306、0.622、0.718、1.294 mg／mL的贮备液，分别精密吸取2.5 mL 置于同一50 mL量瓶中，70%甲醇稀释至刻度，制成质量浓度分别为10.6、 9.8、 48.9、 26.7、 15.3、 31.1、 35.9、64.7 μg／mL 的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液 取片剂适量，除去糖衣，研成细粉，混匀，精密称取3.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 70%甲醇，称定质量，超声提取（250 W、40 kHz） 30 min，擦干外壁，放冷，70%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按片剂质量标准项下的处方和制法，分别制备不含麦冬、地黄、茯苓、丹参的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性试验与专属性考察 精密吸取“2.2.1” ～ “2.2.3” 项下供试品、对照品、阴性样品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由图可知，各成分与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数按各成分计均不低于4 000。

2.3.2 线性关系考察 精密吸取“2.2.1” 项下贮备液适量，70%甲醇分别制成6 个20 倍质量浓度差的线性溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验 取“2.2.1” 项下对照品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、梓醇、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、丹参素、丹参酮ⅡA峰面积RSD 分别为1.15%、1.09%、0.70%、0.89%、0.95%、0.84%、0.76%、0.57%，表明仪器精密度良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.4 重复性试验 取同一批片剂6 份， 按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、梓醇、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、丹参素、丹参酮ⅡA含有量RSD分别为1.82%、0.97%、1.38%、0.75%、1.63%、1.72%、0.39%、1.44%，表明该方法重复性良好。2.3.5 稳定性试验 取同一份供试品溶液，室温下于0、2、4、8、12、16 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、梓醇、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、丹参素、丹参酮ⅡA峰面积RSD 分别为1.17%、1.19%、0.66%、0.89%、0.90%、0.87%、1.74%、0.59%，表明溶液在16 h 内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验 取含有量已知的片剂（批号20170403），除去糖衣，研成细粉，混匀，精密称取6 份，每份约1.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入对照品溶液（0.137 mg／mL 麦冬甲基黄烷酮A、0.104 mg／mL 甲基麦冬二氢高异黄酮B、0.711 mg／mL 梓醇、0.339 mg／mL 去氢土莫酸、0.231 mg／mL 去氢茯苓酸、0.416 mg／mL 茯苓酸、0.479 mg／mL 丹参素、0.994 mg／mL 丹参酮ⅡA）各1.0 mL，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、梓醇、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、丹参素、丹参酮ⅡA的平均加样回收率（RSD）分 别 为 98.08% （1.17%）、 96.89% （1.34%）、99.03% （0.84%）、 98.49% （1.14%）、 97.91%（1.25%）、99.21% （1.06%）、99.60% （0.83%）、100.05% （0.60%）。

2.4 相对校正因子计算 精密吸取“2.3.2” 项下线性溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，以丹参酮ⅡA为内标，计算其他7 种成分的相对校正因子fk／s， 公式为fk／s=fk／fs= （WkAs） ／（WsAk） （Wk为其他成分质量浓度，Ak为其他成分峰面积，Ws为内标质量浓度，As为内标峰面积），结果见表2。

表2 各成分相对校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.5 相对校正因子重复性试验 精密吸取“2.2.1” 项下对照品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，考察Waters 2695、LC-2010 色谱仪和Hypersil ODS-C18、Agilent Zorbax SB C18、Diamonsil C18色谱柱对相对校正因子的影响，结果见表3，可知均无明显影响。

表3 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.6 色谱峰定位 以丹参酮ⅡA为内标，采用相对保留值法考察其他7 种成分在不同色谱仪、色谱柱下与内标的相对保留值，结果见表4，可知均无明显影响。

表4 各成分相对保留值Tab.4 Relative retention values of various constituents

2.7 样品含有量测定 取3 批片剂 （批号20170403、 20170901、 20180101）， 按 “2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，分别采用外标法和一测多评法计算含有量，结果见表5，可知2 种方法无明显差异，相对平均偏差（RAD） 均＜2.0%。

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法选择 本实验首先考察了50%甲醇、70%甲醇［14］、甲醇［8-13，16］对养阴镇静片中麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、梓醇、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、丹参素、丹参酮ⅡA综合提取效率的影响，发现以70%甲醇为溶剂时效果优于50%甲醇（去氢土莫酸、丹参酮ⅡA提取率较低）、甲醇（丹参素提取率较低）。然后，考察了提取方法（超声［8-14］、加热 回 流［9］） 和 提 取 时 间 （15、 30［9-12］、45 min［8，15-16］），发现2 种方法提取30、45 min 对各成分提取率影响相当，均明显高于提取15 min时的去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸，可能与养阴镇静片制备工艺中茯苓粉碎后以细粉入药，麦冬、地黄、丹参提取后入药有关。综合以上结果，同时考虑操作便捷性和可重复性，确定70%甲醇超声30 min 作为供试品溶液制备方法。

表5 各成分含有量测定结果（mg／g，n=3）Tab.5 Results of content determination of various constituents（mg／g，n=3）

3.2 流动相体系选择 本实验首先考察了甲醇-水、乙腈-水［8，16］，发现后者洗脱能力强，分离速度较快，但茯苓酸、去氢茯苓酸色谱峰存在拖尾现象，梓醇色谱峰与杂质峰之间的分离度不理想。在此基础上，又考察了乙腈-0.05%磷酸［12-13］、乙腈-0.1%磷酸［9-10］、乙腈-0.2%磷酸体系，最终选择乙腈-0.1%磷酸作为流动相。

4 结论

近年来，多指标成分定量控制已成为中成药复方制剂质量评价的发展趋势，一测多评法利用中药有效成分之间存在的内在函数和比例关系，通过测定其中1 种质量稳定、对照品易得成分来实现多种成分的同时测定，有效解决了相关分析中对照品需求量大、 检验成本高的弊端， 已得到普遍应用［17-18］。本实验建立一测多评法同时测定养阴镇静片中麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、梓醇、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、丹参素、丹参酮ⅡA的含有量，发现该方法稳定可靠，所得结果与外标法接近，可为该制剂质量标准全面提高和有效评价提供有力的数据支持。