基于UHPLC-QTOF-MS／MS 法分析玳玳花化学成分

饶 颖， 黄文平， 冯育林，3， 欧阳 辉，3， 杨世林，，3∗

（1.甘肃中医药大学，甘肃兰州730000；2.江西中医药大学中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西 南昌330006；3.创新药物与高效节能降耗制药设备国家重点实验室，江西 南昌330006）

玳玳花为芸香科植物玳玳花Citrus aurantium L. var.amara Engl 的花蕾，亦叫枳壳花、酸橙花；大多数分布于长江以南如江苏、浙江、广东等地区，曾收载于1977版《中国药典》 及 《福建省中药材标准》［1-2］。 据文献记载，玳玳花有调气疏肝、 理气宽胸、 开胃止呕等功效，现代药理研究表明其具有抗炎、抗氧化、改善免疫及抗肝损伤等作用［3-5］，亦有江苏、浙江等地民间多于立夏前后，摘取含苞待放的花朵， 用微火烘干， 代茶饮，有药食同源之功效［6-8］。而目前，对玳玳花的化学成分开发研究鲜见报道，为明确其化学成分，为阐释该药的药效物质基础及作用机制提供依据， 本实验运用UPLC-QTOF-MS／MS 技术，对玳玳花的化学成分进行定性研究。该方法简单快捷， 避免粗提、 纯化的繁琐过程，可用于玳玳花的质量控制。

1 材料

岛津LC-30 A 超高效液相色谱仪，包含在线脱气机、高压二元泵、自动进样器、柱温箱 （日本岛津公司）；Triple-TOF 5600+高分辨质谱仪，配备ESI 离子源及Analyst 1.6 数据处理软件、Peak View 数据处理软件（美国AB Sciex 公司）；HC-3018R 型高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；Millipore-Simplicity 超纯水处理系统（德国默克密理博公司），KQ-400DB 型超声清洗机（巩义市予华仪器有限责任公司）， AL204 型电子分析天平［Mettler Toledo 仪器（上海） 有限公司］。

对照品秦皮乙素（批号110741-201708）、咖啡酸（批号110885-201703）、异荭草素（批号140926-201109）、槲皮苷（批号111538-201606）、山柰酚-3-O-芸香糖苷（批号112007-201602）、芸香柚皮苷（批号110722-201714）、柚皮苷（批号110722-201714）、3，5-二咖啡酰奎宁酸（批号111782-201706）、4，5-二咖啡酰奎宁酸 （批号111894-201102）、新橙皮苷（批号110721-201617）、橙皮苷（批号110721-201617）、 山 柰 酚 （110861-201611）、 槲 皮 素（批号100081-201610）、芹菜素（批号111901-201603）、大黄酸（批号110757-201607）、银杏内酯A（批号110862-201612），均购于中国食品药品检定研究院。奎宁酸（批号BCTG-170303）、白蜡树苷（批号BCTG-160512）、二氢咖啡酸 （批号BCTG-160402）、隐绿原酸 （批号BCTG-170407）、3，4-二咖啡酰奎宁酸（批号BCTG-150201）、4-羟基肉桂酸 （批号BCTG-150803）、异夏佛托苷 （批号BCTG-160702）、木 犀 草 素-7-O-葡 萄 糖 苷 （批 号BCTG-160723）、蝶豆宁 （批号BCTG-150323）、圣草酚 （批号BCTG-160213），均购于江西本草天工科技责任有限公司。玳玳花（浙江嘉兴，批号170329）。乙腈、甲酸色为谱纯，水为超纯水，其余均为分析纯。

2 方法

2.1 分析条件

2.1.1 色谱条件 采用Shim-Pack XR C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相0.1% 甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0.01 ～4 min，2%B；4 ～6 min，2%～5%B；6～10 min，5%～10%B；10～20 min，10%～20%B；20～30 min，20%～28%B；30 ～45 min，28%～70%B；45 ～50 min，70%B；50～52 min，70%～2%B；52 ～60 min，2%B）；体积流量0.25 mL／min；柱温40 ℃；进样量2.0 μL。

2.1.2 质谱条件 采用电喷雾电离源（ESI），负离子模式；质量扫描范围为m／z 100～1 200；喷雾电压-4 500 V；雾化气温度600 ℃；气帘气172.36 kPa；雾化气和辅助气344.74 kPa；去簇电压 （DP）120 V；采用TOF-MS-IDAMS／MS 方法采集数据，TOF／MS 一级预扫描和触发的二级扫描TOF／MS／MS 离子累积时间分别为500、200 ms；CE碰撞能量为-38 eV。

2.2 对照品溶液制备 精密取各对照品适量，分别加甲醇配制成0.2 mg／mL 的溶液，备用。

2.3 供试品溶液制备 取玳玳花粉末（过4 号筛）0.3 g，加甲醇25 mL，称定质量，回流30 min，放冷，过滤，滤液置8 000 r／min离心机中离心，过0.22 μm 滤微孔滤膜，即得。

3 结果与分析

3.1 化学成分鉴定 UHPLC-QTOF-MS／MS 法对玳玳花成分进行定性分析，质谱总离子流图见图1。结合样品中各色谱峰的精确质量数、分子式及碎片峰信息，推测了各色谱峰可能的结构。主要色谱峰的保留时间，质谱信息，推测的分子式，化合物及其碎片离子归属等见表1。

图1 负离子模式总离子流图

表1 化学成分分析

续表1

续表1

3.2 成分分析

3.2.1 酚酸类 峰9 的一级质谱数据见表1，表明［M-H］离子为m／z179.034 7，Peakview1.2 软件给出其元素组成（预测分子式） 为C9H8O4，误差为-1.4；二级碎片离子峰m／z 为161.029 0，135.045 2，107.049 7，79.056 5；根据对照品信息比对可以鉴定峰9 为咖啡酸见图2。在二级质谱中，峰9 产生的碎片离子主要为135.045 2，进一步证明峰12 物质母核结构上羟基缩合脱水，得到m／z 161.029 0碎片离子，同时侧链上失去CO2和苯环上失去CO，而产生碎片离子135.045 2 和107.049 7。同理［9-12］鉴定了峰4、11 等。

3.2.2 香豆素类 峰8 的主要产生m／z 为177.019 3 的［M-H］离子，二级质谱有161.031 5，149.022 5，133.030 3，105.043 0 的碎片离子，主要裂解见图3；通过对照品信息，推测可能为秦皮乙素。根据上述裂解途径，通过相关文献［13-15］，同理鉴定了峰23。

3.2.3 黄酮类 峰35 的母离子m／z 609.1854，发现二级489.142 8，343.082 5，301.071 3，主要裂解见图4；根据ChemSpider 数据库及对照品信息，成分鉴定为橙皮苷。根据上述裂解途径及相关文献［16］，同理鉴定了峰27、29、33、36 等。

3.2.4 其他成分 峰57 的母离子m／z 293.212 2，发现二级235.169 6，211.133 4，191.180 2，155.106 9，127.119 0，121.101 6，109.064 4，133.058 4，81.037 2，根据ChemSpider 数据库，推测可能成分为13-HoTrE（r），根据上述裂解途径及相关文献［17］，同理鉴定了峰55、58。

图2 咖啡酸裂解途径

图3 秦皮乙素裂解途径

图4 hesperidin 裂解途径

4 讨论

玳玳花自古以来都是重要的既能治疗疾病又能当日常凉茶饮用的药材，具有多种药理活性，但其物质基础尚缺少研究。本实验采用UHPLC-QTOF-MS／MS 联用技术检测玳玳花中的58 种化学成分，其分析时间短，溶剂消耗少，分离效果及分析效率大幅度提升；可以提高保留时间重现性及色谱分辨率，有着超高分离度、超高灵敏度的特点。能够快速对复杂的化学成分体系进行分析［20-22］，是目前研究、推测中药成分的有效手段。

本研究运用UHPLC-QTOF-MS／MS 技术对玳玳花进行化学成分分析鉴定尚属首次，其化学成分主要为黄酮和酚酸类，多是既能治疗疾病又是能提高人体免疫力的基础物质，例如黄酮类的柚皮苷，具有抗炎镇痛、抗病毒、抑菌及抑制眼醛糖还原酶的等作用，在临床上能用于降低血胆固醇、减少血栓的形成，改善局部微循环和营养供给，亦防治心脑血管等疾病［23］。山柰酚具有良好的抗菌活性，能有效地抗感染及抑制炎症因子，临床上多用来防治糖尿病及动脉粥样硬化等疾病，均有良好的疗效［24］，这些成分都为玳玳花在抗炎、抗氧化、改善免疫及抗肝损伤等作用提供较好的物质基础，以期为玳玳花的质量控制指标的选择及药效研究提供了物质基础，并为后续玳玳花药理作用研究及其机制研究提供了详实的数据支撑，对其保健开发及临床应用奠定基础。