大蓟止血片HPLC 指纹图谱研究

沈丹萍， 詹常森， 姜 鹏

（上海和黄药业有限公司，上海中药固体制剂创新工程技术研究中心，上海201401）

大蓟止血片由大蓟和干姜2 味药材组成，主要功效为凉血、止血，临床应用于妇女功能性子宫出血、子宫复旧不全等。处方大蓟4 880 g、干姜120 g，大蓟水提醇沉浓缩，干姜醇提浓缩， 两者混合干燥， 加辅料压制成1 000片。

大蓟，为菊科植物蓟Cirsium japonicum Fisch.ex DC.的干燥地上部分，有凉血止血、散瘀解毒消痈之功效［1］。大蓟因抗出血被广泛应用于外伤性出血、高血压和炎症的治疗［2］。大蓟止血的主要药效成分为黄酮类［3］，其中柳穿鱼叶苷和蒙花苷促凝血、止血作用被较多报道［4-5］。干姜，为姜科植物姜Zingiber offcinale Rosc.的干燥根茎，有温中散寒、回阳通脉、温肺化饮之功效，常用于治疗脘腹冷痛、呕吐泄泻、肢冷脉微、寒饮喘咳［1］。干姜主要的有效成分为姜辣素［6-8］。

大蓟止血片现检测标准采用中药部颁标准（WS3-B-2468-97-1），标准中质量控制只有针对大蓟的薄层鉴别。为了更加全面的控制大蓟止血片质量，以保障临床用药安全性，需进一步建立大蓟止血片的质量控制方法。

文献已有大蓟与干姜的指纹图谱、含有量测定和化学成分分析方法的相关报道［1，9-14］，在此基础上，本实验结合大蓟和干姜的主要药效物质，建立了大蓟止血片指纹图谱，较为全面控制大蓟和干姜2 味药材，同时解决了干姜量少检测难问题，以期为进一步严格药材和成品质量提供参考。

1 材料

1.1 仪器与试剂 Agilent 1100（配有DAD 检测器，美国Agilent 公司）；AL204 电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。乙腈、磷酸（色谱纯，美国Tedia 公司）；Milli-Q纯水仪（美国Millipore 公司）；其余所用试剂均为分析纯。柳 穿 鱼 叶 苷 对 照 品 （111728-201502）、 芦 丁 对 照 品（100080-201409），均购自中国食品药品检定研究院；蒙花苷对 照 品 （I-009-140730）、 6-姜 辣 素 对 照 品 （J-019-140703），均购自上海远慕生物科技有限公司；8-姜酚对照品（141015）、10-姜酚对照品（141127），均购自上海古朵生物科技有限公司。

1.2 样品 本实验收集了10 批大蓟止血片（0.4 g／片，36 片／瓶）， 批 号 分 别 为 150522、 150527、 150610、150703、 150707、 150709、 150805、 150807、 150825、150827。以上样品均由上海和黄药业有限公司提供。大蓟药材购自江西樟树天齐中药饮片有限公司；干姜药材购自上海封浜中药饮片有限公司。

1.3 阴性样品 缺大蓟阴性样品，取干姜36 g，精密称定，按生产工艺要求提取浓缩干燥，加一定比例的辅料使满足大蓟止血片要求质量。缺干姜阴性样品，取大蓟1 464 g，精密称定，按生产工艺要求提取浓缩干燥，加一定比例的辅料使满足大蓟止血片要求质量。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters Atlantis T3色谱柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温30 ℃；流动相乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脱，程序见表1；体积流量1.0 mL／min；检测波长0～65 min（330 nm）、65～125 min（240 nm）；进样量5 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备 分别取柳穿鱼叶苷、芦丁和蒙花苷对照品约10 mg，6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚对照品约20 mg，精密称定，用90%乙醇溶于25 mL 量瓶中，定容，作为贮备液置4 ℃冰箱避光保存。分别取对照品贮备液适量稀释，制成混合对照品溶液，柳穿鱼叶苷、芦丁和蒙花苷质量浓度均为50 μg／mL，6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚质量浓度均为100 μg／mL。

2.2.2 供试品溶液制备 取大蓟止血片粉末20 g，放入50 mL 离心管中，精密称定，加入10%乙醇30 mL，超声30 min，3 000 r／min，离心20 min，去上清，处理2 次；残渣加入30%乙醇30 mL，超声30 min，3 000 r／min，离心20 min，去上清， 处理2 次； 残渣继续加入无水乙醇30 mL，超声30 min，3 000 r／min，离心20 min，取上清，处理2 次，合并2 次无水乙醇提取液的上清，蒸干，用90%乙醇定容至5 mL，用0.22 μm 微孔滤膜过滤。

表1 梯度洗脱程序

2.2.3 阴性样品溶液制备 取阴性样品粉末各20 g，精密称定，按“2.2.2” 项下方法制备阴性供试品溶液。

2.2.4 药材溶液制备 分别取大蓟、干姜粉末各0.5 g，精密称定，按“2.2.2” 项下方法制备药材供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取150522 样品1 份，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下，连续进样6 次，以9 号峰（柳穿鱼叶苷） 为参照峰，结果21 个共有峰的相对保留时间RSD 均小于0.3%，相对峰面积的RSD 均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取150522 样品6 份，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下，以9 号峰（柳穿鱼叶苷） 为参照峰，结果21 个共有峰的相对保留时间RSD 均小于0.2%，相对峰面积的RSD 均小于3%，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取150522 样品1 份，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下，分别于0、4、8、12、16、24 h 测定，以9 号峰（柳穿鱼叶苷）为参照峰，结果21 个共有峰的相对保留时间RSD 均小于0.3%，相对峰面积RSD 均小于3%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4 HPLC 指纹图谱建立

2.4.1 共有峰标定 将10 批大蓟止血片色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2009 版），以S1 为参照图谱，平均数法生成对照图谱见图1，叠加图谱见图2。结果，共标定出21 个共有峰，以9 号峰为参照峰（S），计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表2。不同样品相对保留时间的RSD 均小于0.3%；相对峰面积RSD在4%～25%之间。

表2 10 批样品共有峰相对保留时间和相对峰面积

图1 样品对照指纹图谱

图2 10 批样品HPLC 指纹图谱

2.4.2 相似度分析 采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2009 版），对10 批样品的指纹图谱数据进行分析，样品与对照指纹图谱的相似度结果见表3。由表可知，10 批样品相似度在0.95 以上，表明该指纹图谱具有代表性。

表3 10 样品相似度

2.5 共有峰来源分析 大蓟止血片只有2 味药组成，通过大蓟止血片样品、缺样阴性样品和药材三者色谱图对比，分析共有峰来源见图3～4。大蓟止血片样品与缺大蓟样品色谱图对比，发现缺大蓟样品中未见峰1 ～11、峰13 ～14、峰16，表明14 个共有峰来源于大蓟；再与大蓟药材色谱图比较后，发现峰1～2、峰5、峰7～11，峰16 等9 个共有峰直接来源于大蓟药材，而峰3 ～4、峰6、峰13 ～14 等5 个共有峰来源于大蓟生产过程产生。同理可知，峰12、峰17～21 等6 个共有峰直接来源于干姜药材。峰15 来源于大蓟与干姜。同时通过与对照品色谱图对比后见图5，发现峰8 为蒙花苷、峰9 为柳穿鱼叶苷、峰12 为6-姜辣素、峰17 为10～姜酚。

3 讨论

3.1 检测波长选择 根据文献报道大蓟主要紫外吸收为330 nm［9］，干姜240 nm［12-13］。因而在同一条件下，对比330、240 nm 波长下检测到的液相图谱，发现330 nm 波长下检测不到干姜的成分，而在240 nm 波长下基线不稳，且色谱峰杂，峰形不好。根据大蓟和干姜各自色谱峰的出峰情况， 较合适的检测为前65 min， 检测波长330 nm，65 min至检测结束，检测波长240 nm。

3.2 提取条件选择 根据工艺及检测结果发现，大蓟中的化学成分极性较大，而干姜中的化学成分极性较小，两者极性差异较大；另外两者含有量在大蓟止血片中差异很大，大蓟为主要药材，大蓟止血片中达到95%以上，干姜可以忽略不计。基于此，采用简单的样品处理方法不能检测到干姜的成分，因此经过多次试验后发现，先用10%乙醇提取，中间用30%乙醇提取，最后采用无水乙醇提取，这样2 种药材中的成分均可检测到。

本研究发现，10 批样品21 个共有峰相对保留时间差异较小，表明色谱峰出峰稳定；从峰面积变化程度来看，各批次21 个共有峰中有多个色谱峰相对峰面积变化较大，表明不同批次各成分个体的相对量上有差异性。但指纹图谱的建立是基于整体上辨认样品的真实性，样品间的差异并没有影响到大蓟止血片指纹图谱整体面貌的“共性特征”，不影响真实性判断。这些个体成分量上的差异对指纹图谱整体相似度影响不大。

图3 大蓟止血片共有峰归属分析图

图4 大蓟止血片共有峰归属分析图

图5 对照品色谱图

本实验利用HPLC-UV 对大蓟止血片进行分析，建立了大蓟止血片指纹图谱，既反应了大蓟成分，也反应了干姜成分，较全面的控制大蓟止血片质量，还可通过指纹图谱反应不同批次间量的差异，对其质量控制具有一定意义。