水苏碱在乙醇中的纳滤分离行为

李存玉， 李贺敏， 支兴蕾， 刘莉成， 李红阳， 彭国平∗

（1.南京中医药大学药学院，江苏南京210023；2.江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏南京210023）

以乙醇为代表的有机溶剂在中药制药领域中应用广泛，但衍生出的提取物、萃取物、洗脱部位在进行精制纯化时，高温处理所带来的成分转化会严重影响目标产物质量，同时因回收溶剂比例变化而难以循环利用， 造成资源浪费、 环境污染［1］。1993 年高从堦院士首次提出常温化精制的纳滤分离技术［2］，其截留分子量在100 ～1 000 Da 之间，分离特点与超滤、微滤有所不同，因其膜材质表面的荷电性，分离过程为电荷、位阻、溶解-扩散效应等多种效应综合的结果［3-4］，但针对有机溶液环境下中药成分的纳滤精制研究尚处于探索阶段［5］。

水苏碱是益母草中主要药效成分［6］，在光照和长时间加热下均会降解，影响制剂质量的同时也造成药用资源的浪费，在对其进行色谱分离时制得以乙醇为洗脱液的中间体，大多采取低温减压回收来控制成分的降解，但生产效率偏低。本实验探索纳滤技术对乙醇中水苏碱富集的适用性，并结合膜面溶胀特征阐明该成分的分离规律，为明确有机溶液环境下纳滤分离机制提供参考依据。

1 材料

1.1 试药 复合聚酰胺纳滤膜（孔径150、475、800 Da，南京拓鉒医药科技有限公司）。盐酸水苏碱对照品（批号110773-201313，中国食品药品检定研究院）。益母草提取物（自制，益母草饮片加水提取后色谱分离制备得到， 水苏碱含有量＞70%）。乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器 TNZ-1 型纳滤分离设备（南京拓鉒医药科技有限公司）；e2695 高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；ELSD 6000 检测器（美国Alltech 公司）；MS105 电子天平［十万分之一，梅特勒-托利多仪器（上海） 有限公司］。

2 方法

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取盐酸水苏碱对照品3.60 mg，置于5 mL 量瓶中，流动相超声溶解，定容至刻度，即得（每1 mL 含0.72 mg 该成分）。

2.1.2 供试品溶液 益母草提取物用不同体积分数乙醇配制成5.0%、17.5%、30.0%，其中盐酸水苏碱质量浓度为105.0 μg／mL。

2.2 纳滤分离 采用前期建立的方法［7］，按照图1 组装纳滤膜、中压泵等纳滤装置，设置操作压力为1.0 MPa。将纳滤膜置于分离系统中，纳滤分离初始阶段需要药液在纳滤膜中循环平衡，排除因膜材质对成分吸附的干扰，待盐酸水苏碱与膜组件之间的吸附、解吸附达到平衡时，从储液罐中取样平衡液，进而开始纳滤，纳滤液罐收集纳滤液，待样品纳滤分离至无法维持系统分离时，关闭纳滤系统，纳滤液中取样纳滤液。

图1 纳滤分离设备Fig.1 Nanofiltration separation equipment

2.3 盐酸水苏碱含有量测定

2.3.1 色谱条件［8］Waters Xbridge Hilic 色谱柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；流动相乙腈-0.2%冰醋酸（80 ∶20）。蒸发光散射检测器参数为漂移管温度80 ℃，气体体积流量2.0 L／min；体积流量0.8 mL／min。

2.3.2 线性关系考察 精密吸取对照品溶液1、2、5、10、20 μL，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定。以峰面积（Y）、进样量（X） 取对数进行回归，得方程为Y=0.56X+4.60（R2=0.999 5），在0.72～14.4 μg 范围内线性关系良好。

2.4 截留率计算 取纳滤分离制备的纳滤液（C1） 及平衡液（C2），测定峰面积并取对数后代入“2.3.2” 项下回归方程，计算盐酸水苏碱含有量，按照式（1） 计算截留率（R）。

2.5 水苏碱分离数据积累 应用Design-Expert 8.06软件［9］，考察乙醇体积分数（A）、pH 值（B）、膜孔径（C） 对盐酸水苏碱纳滤分离行为的影响，以截留率（Y）为评价指标。因素水平见表1。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

2.6 纳滤分离层溶胀分析 为了排除膜污染带来的干扰，在操作压力1.0 MPa 条件下分别选择空白水溶液及5%、7.5%、30%乙醇，考察膜面因溶胀带来的通量衰减变化，见式（2）、 （3）。其中，J0为初始通量，单位m／s；Jt为单位时间t 时的膜通量，单位m／s；m 为膜通量衰减系数。

3 结果

3.1 纳滤分离数据积累 根据响应面分析原理［10-11］，为保障实验结果的准确性和稳定性，每组平行3 次，取平均值，结果见表2。

表2 试验设计及结果Tab.2 Design and results of tests

3.2 模型拟合 对各因素进行二次多项回归拟合，得方程为Y=39.44-7.26A-4.77B-19.04C+2.43AB+2.96AC-3.23BC+20.52A2+38.28B2+2.20C2，方差分析见表3。由表可知，各因素影响程度依次为C＞A＞B；P＜0.000 1，表明模型极显著；多元相关系数R2=0.985 7，预测R2=0.824 8，调整R2=0.967 3，表明模型拟合度良好。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

3.3 因素分析 图2 显示，在固定膜孔径、乙醇体积分数时，随着pH 值逐渐升高，截留率呈先下降后升高的趋势，并在30%乙醇中最明显，推测水苏碱两性结构中碱性、酸性基团解离状态不同，pH 增加时碱性基团阳离子首先过渡至化合物等电点，然后在碱性环境中羧基解离成阴离子，再结合纳滤分离的电荷效应［12］；在固定pH 值、乙醇体积分数时，截留率随着孔径增加而降低，分离规律符合孔径筛分规律；在固定pH 值、膜孔径时，乙醇体积分数对截留率的影响呈不同的调节规律，在酸碱极端环境下，乙醇可增强纳滤膜截留效率，但在中性至弱碱条件下，反而会促进成分纳滤透过。

表2、图2 显示，水苏碱中的羧基在强碱性条件下以钠盐形式存在，与纳滤膜电荷排斥效应明显，在475 Da 纳滤中的截留率高于80%，乙醇体积分数从5%升至30%时，截留率由82.32%升至91.48%；在酸性条件下，水苏碱以盐酸盐形式存在，乙醇体积分数从5%升至30%时，截留率由95.22%升至96.29%，推测碱性条件下该成分可能未完全解离，纳滤分离时产生的电荷排斥效应弱于酸性条件。

3.4 膜溶胀分析 表4 显示，随着乙醇体积分数增加，衰减系数绝对值也随之升高，相较于水溶液环境，乙醇体积分数增加至5%时单位时间内膜通量衰减明显，随着其升高通量衰减加剧，但超过17.5%后衰减系数相对稳定，表明膜溶胀程度已趋于稳定［13］。

图2 各因素响应面图Fig.2 Response surface plots for various factors

表4 不同乙醇体积分数下纳滤膜衰减系数Tab.4 Decay coefficients of nanofiltration membranes under different ethanol concentrations

4 讨论

随着溶液环境由水逐步向有机相过渡，成分状态、膜面分离层物化性质、成分的跨膜传质行为均发生变化，进而引起分离行为变化［14-15］。其中，在酸、碱性条件下乙醇体积分数增加引起的水苏碱截留率升高，表现出不同程度“强化” 截留率的行为，而且其升高程度并不完全是由膜面溶胀引起的。同时表2 显示，在150 Da 纳滤膜中，pH 7.0下乙醇体积分数从5%升高至30%时，截留率由81.87%降低至70.42%，即乙醇体积分数升高引起膜溶胀加剧，水苏碱截留率反而下降，与上述结果相悖，推测两性生物碱纳滤跨膜传质机制可能与成分存在状态相关。

纳滤分离的经典模型大多基于水溶液环境建立，其适用性有待于验证，本实验中水苏碱纳滤截留行为随着乙醇体积分数、pH 值变化的现象仅靠电荷效应、位阻效应等分离模型无法得到有效解释。对水苏碱存在状态进行分析，发现随着溶液pH 由酸性向碱性环境的过渡，该成分呈现出酸、碱性基团解离-游离的转换状态，当两性基团正负电荷数值相等时，即为等电点。由此推测，酸、碱性条件下水苏碱在乙醇中的解离基团随着溶剂体积分数升高，其溶解度逐步降低，而游离态基团溶解度变化随之相反，从而表现出类表面活性剂性质，并通过分子间缔合团聚的形式在溶液中存在，故在纳滤过滤时“强化” 截留率是由膜面溶胀和分子团聚综合引起的。另外，在水苏碱等电点附近呈电中性状态，由于乙醇可降低分子间表面能，促进多分子团聚态状态向低分子团聚态或单分子态转移，而且此时单分子、低分子团聚态水苏碱比例高于水溶液环境，故此时“削弱” 截留率的行为可能是由存在状态结构大小、膜面溶胀引起的。

对水苏碱跨膜传质过程进行分析，推测在含有乙醇的水溶液环境中，等电点时水苏碱可能更容易接近膜分离层而通过纳滤膜，同时因分子间作用力差异，乙醇与复合聚酰胺材质作用力大于水分子，推测纳滤膜表面乙醇体积分数可能稍高于溶液内部。因此，解离态水苏碱因溶解度与乙醇体积分数呈反比，并在膜面电荷排斥的协同作用下难以进入膜分离层，从而呈现出高截留率现象。

有机溶剂的合理回收和循环利用有助于中药制药企业实现节能减排，但分离机制有待于进一步完善。本实验对两性化合物水苏碱在乙醇中的纳滤分离行为进行分析，今后将结合分离规律建立纳滤传质模型，从而为提升化学成分在有机溶液环境中的适用性、研制耐有机溶剂纳滤膜提供技术支撑。