玉竹中4种高异黄烷酮的二次层析薄层色谱法快速鉴别研究*

张 颖，白 晶，吕 振，瞿志杰，李美丽，徐 涛，李 莉△

（1.哈尔滨商业大学药学院·药物工程技术研究中心，黑龙江 哈尔滨150076；2.齐齐哈尔医学院药学院，黑龙江 齐齐哈尔161006）

玉竹是百合科植物玉竹Polygonatum odoratum（Mill.）Druce的干燥根茎，药食同源[1]，富含20余种高异黄酮成分[2-11]，其中4种高异黄烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ含量相对较高，且具有较强的生物活性。高异黄烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ均具有较强的抑菌活性[12]，高异黄烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ对蛋白质非酶糖基化半数抑制量（IC50）分别为107.10，46.05，56.30 μmol/L[13]，高异黄烷酮Ⅲ，Ⅳ对人白血病细胞（K562）、人肺癌细胞（A549）、人结肠癌细胞（HCT-15）的IC50分别为6.5，20.8，8.5 μg/mL和26.2，25.2，15.3 μg/mL[14]。2015年版《中国药典（一部）》中玉竹中药效物质的检测方法仅有多糖总量不低于6.0%与醇提物总量不低于50.0%，未对高异黄烷酮成分进行质量控制[15]，不能全面反映玉竹质量。本研究中建立了玉竹中4种高异黄烷酮活性成分的薄层色谱（TLC）鉴别方法，旨在进一步控制其质量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

C18-H固相萃取柱（4 000 mg/20 mL，BESEP，Germany）；GF254铝制薄层板（10 cm×10 cm，10 cm×11 cm，Merck KGaA Darmstadt，Germany）；XS3DU型电子分析天平（Mettler Toledo公司，精度为0.000 001 g）；SC-5型紫外分析仪（北京金剑之光医药信息技术中心）；双槽层析缸（120 mm×115 mm×5 mm，上海鼎杰生物科技有限公司）；N-1001型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；微量进样器（上海高鸽工贸有限公司，10 μL）；定量毛细管（杭州驰成医药科技有限公司，10 μL）。

1.2 试药

二氯甲烷、甲醇、甲酸、乙醇、石油醚、乙酸乙酯均为市售分析纯；高异黄烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ对照品[自制，经高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）法和核磁共振波谱法（NMR）鉴定，纯度均大于98.0%]；20批玉竹（按2015年版《中国药典（一部）》检验均符合规定）来源见表1，其中编号1～15为饮片、16～20为药材。

表1 不同批次玉竹的基本信息

2 方法与结果

2.1 溶液制备

对照品溶液：分别取4种高异黄烷酮对照品Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ适量，精密称定，分别用甲醇配制成0.4 mg/mL的溶液，置棕色瓶中，密闭，即得。

供试品溶液：取干燥玉竹粗粉约3.3 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加乙醇14 mL，浸泡15 h，水浴（80℃）加热回流2 h，取上清液，如上重复提取1次，合并2次上清液，趁热抽滤，将滤液转移至蒸发皿中，水浴（78℃）蒸干，加入7 mL水，振摇，得浑浊液，转移至C18-H固相萃取柱中，将水溶液滤净，再用7 mL水洗脱，弃去水溶液；用10 mL甲醇缓缓洗脱上述C18-H固相萃取柱，将洗脱液置蒸发皿中，水浴（78℃）蒸至约1 mL，转移至1.5 mL棕色瓶中，用氮气吹干，再用100 μL甲醇定容，密闭。

阳性样品溶液：以玉竹S1和S6[采用超高效液相色谱（UPLC）法检测，高异黄烷酮Ⅲ及Ⅳ的含量大于40 μg/g，高异黄烷酮Ⅰ及Ⅴ的含量大于6 μg/g]作为阳性样品或对照药材。分别取其粗粉约3.3 g，按供试品溶液制备方法制得。

阴性样品溶液：以玉竹S16（采用UPLC检测，高异黄烷酮Ⅲ及Ⅳ的含量低于3 μg，高异黄烷酮Ⅰ及Ⅴ的含量低于0.6 μg/g）作为阴性样品。取其粗粉约3.3 g，按供试品溶液制备方法制得。

模拟阳性样品溶液：取阴性样品粗粉约3.3 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入高异黄烷酮Ⅲ90 μg，高异黄烷酮Ⅳ80 μg，高异黄烷酮Ⅴ24 μg，高异黄烷酮Ⅰ8 μg，作为模拟阳性样品。按供试品溶液制备方法制得。

2.2 薄层色谱法建立

2.2.1 色谱条件选择

4种高异黄烷酮化学结构（图1）相近，极性差异小，主要区别在于8位与4′取代基是甲基、甲氧基还是羟基，故在同一色谱条件下，很难将4个化合物有效分离。

图14 种高异黄烷酮化学结构式

采用GF254薄层板，以三氯化铁试液显色，分别考察了甲苯-乙酸乙酯-甲酸、甲苯-甲醇-甲酸、石油醚-甲醇、石油醚-乙酸乙酯、石油醚-乙酸乙酯-甲酸5个非极性及弱极性展开系统的TLC。结果显示，石油醚-乙酸乙酯（3∶2，V/V）对4种高异黄烷酮的分离效果最佳，但无法有效分离高异黄烷酮Ⅳ及Ⅴ。详见图2A。

采用GF254薄层板，以254 nm波长检视，分别考察了二氯甲烷-甲醇、二氯甲烷-甲醇-甲酸、二氯甲烷-甲醇-水3个中等极性展开系统的TLC。结果显示，二氯甲烷-甲醇-甲酸（150∶5∶3，V/V/V）对4种高异黄烷酮的分离效果最佳，但无法有效分离高异黄烷酮Ⅲ及Ⅳ。见图2 B。

2.2.2 二次层析薄层色谱法

分别取4种高异黄烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ对照品溶液、对照药材与供试品溶液各10 μL，点于同一GF254薄层板上，置含有10 mL二氯甲烷-甲醇-甲酸（150∶5∶3，V/V/V）的层析缸中，饱和，层析，取出，晾干，于254 nm或365 nm波长处检视与定位（通常高异黄烷酮Ⅲ，Ⅳ不能有效分离），在对照品高异黄烷酮Ⅴ与高异黄烷酮Ⅳ间画一条平行于底边的直线，沿此线将该TLC板剪裁成两部分。立即将下半部分用三氯化铁试液喷雾，并用滤纸将水吸干，对照药材、供试品溶液主斑点的位置及颜色均应与高异黄烷酮Ⅴ对照品主斑点相同；将上半部分用6 mL石油醚-乙酸乙酯（3∶2，V/V）二次层析，立即用三氯化铁试液检视，对照药材、供试样品主斑点的位置及颜色均应分别与高异黄烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ对照品主斑点相同。

图2 薄层色谱图

2.3 方法学验证

2.3.1 阴性样品干扰试验

分别取4种高异黄烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ对照品、阳性样品、模拟阳性样品与阴性样品溶液，各10 μL，点于同一GF254薄层板上，按2.2.2项下方法操作。结果见图3。阳性样品、模拟阳性样品主斑点的位置、颜色分别与4种对照品的主斑点相同，而阴性样品无相应斑点，说明玉竹中其他成分对高异黄烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ检测结果无干扰，方法有较强的专属性。

图3 阴性样品对4种高异黄烷酮薄层色谱的干扰试验

2.3.2 检测限（LOD）考察

分别量取0.7，1.3，2.5，5.0，10.0 μL高异黄烷酮Ⅰ，Ⅳ，Ⅲ，Ⅴ对照品溶液（相当于高异黄烷酮0.3，0.5，1.0，2.0，4.0 μg），依次点于同一块GF254薄层板上，按2.2.2项下方法操作，高异黄烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ的展开剂为二氯甲烷-甲醇-甲酸（150∶5∶3，V/V/V），高异黄烷酮Ⅴ的展开剂为石油醚-乙酸乙酯（3∶2，V/V），依次在254nm和365 nm波长处与三氯化铁试液显色项下检视，结果见表2与图4。三氯化铁试液检视的灵敏度较高，高异黄烷酮Ⅰ，Ⅳ，Ⅲ，Ⅴ的LOD分别为2.0，2.0，1.0，1.0 μg。

表2 不同检视方法下4种高异黄烷酮TLC的LOD（μg）

图44 种高异黄烷酮薄层色谱的检测限

2.3.3 稳定性考察

供试品溶液：分别取4种高异黄烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ对照品与供试品溶液适量，置1.5 mL加盖棕色瓶中，放置0，1，2，4，8，24 h后，按2.2.2项下方法操作，依次在254 nm和365 nm波长处与三氯化铁试液显色项下检视，结果6个时间点的TLC主斑点无显著差异，表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。

TLC三氯化铁试液显色：按2.2.2项下方法操作，分别取4种高异黄烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ对照品溶液，点于同一GF254薄层板上，在365 nm波长下检视。在室温下，1 h后Ⅲ，Ⅴ主斑点的颜色与面积逐渐变淡、变小，高异黄烷酮Ⅰ，Ⅳ24 h内未变，详见图5 A；在加热（80℃）条件下，10 min后高异黄烷酮Ⅲ，Ⅴ主斑点的颜色与面积逐渐变淡、变小，高异黄烷酮Ⅰ，Ⅳ60 min内未变，详见图5 B。可见，高异黄烷酮Ⅲ，Ⅴ在空气中的稳定性较差，且加热可加速其氧化变质。按2.2.2项下方法操作，将4种高异黄烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ对照品和供试品溶液的TLC用三氯化铁显色后，观察室温下0，1，2，4，8，24h时的变化，24 h内主斑点的颜色与大小无显著差异，表明显色后的成分较稳定。

可见，4种高异黄烷酮溶液及其TLC三氯化铁试液显色后均较稳定，但TLC主斑点显色前不稳定，特别是高异黄烷酮Ⅲ，Ⅴ在加热条件下极不稳定，可能源于高异黄烷酮Ⅲ，Ⅴ结构中8位含有游离的酚羟基（见图1），在空气中极易被氧化。建议2.2.2项下层析后采用自然晾干，并立即用三氯化铁试液显色，可有效避免假阴性现象。

图5 不同条件下4种高异黄烷酮薄层色谱图（365 nm）

2.4 样品检测

将4种高异黄烷酮对照品Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ和20批玉竹样品（S6为对照药材）溶液按序号依次点于同一GF254薄层板上，按2.2.2项下方法操作，结果见图6与表3。可见，有5批玉竹（S1～S4，S6）检出高异黄烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，8批玉竹（S5，S7～S10，S12～S14）仅检出高异黄烷酮Ⅲ，Ⅳ，7批玉竹（S11，S15～S20）未检出高异黄烷酮。

图6 二次层析薄层色谱法鉴别玉竹中4种高异黄烷酮（蓝底-365 nm；灰底-三氯化铁显色）

表320 批玉竹中高异黄烷酮检测结果

图720 批玉竹中4种高异黄烷酮的检出情况

2.5 不同产地玉竹质量差异

按表3将玉竹中高异黄烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ检测结果进行归类分析，结果见图7。可见，20批玉竹中检出高异黄烷酮Ⅲ，Ⅳ的共13批，其中5批均检出高异黄烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，8批检出高异黄烷酮Ⅲ，Ⅳ。此外，还有7批玉竹中均未检出高异黄烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ。说明不同产地玉竹中高异黄烷酮存在显著差异。

3 讨论

3.1 样品提取条件选择

取同一批玉竹，按2.1.2项下方法操作，分别将不同条件下获得的玉竹提取液用UPLC及TLC检测。结果，分别用粗粉与碎块2种形态进行提取，前者提取效率较高；分别以70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、甲醇作为提取溶剂[16]，除前2种提取效率较低外，其他提取效率相近，因95%乙醇无害、价廉，故以此作为本研究中的提取溶剂；分别采用超声与回流提取，后者提取效率更高[17]；分别采用水沉后离心过滤与水沉后用C18-H固相萃取柱处理作为纯化手段，后者TLC对主斑点干扰小。

3.2 薄层色谱展开方式选择

由4种高异黄烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ的TLC图谱可见，在石油醚-乙酸乙酯（3∶2，V/V）中高异黄烷酮Ⅳ，Ⅴ未分离，仅能鉴别高异黄烷酮Ⅰ，Ⅲ；而在二氯甲烷-甲醇-甲酸（150∶5∶3，V/V/V）中，Ⅲ，Ⅳ不能分离，仅能鉴别高异黄烷酮Ⅰ，Ⅴ。由2.2.2项下可见，通过将上述2种展开方式整合，剪掉首次层析后TLC中Rf值最低的主斑点（Ⅴ），对混合物斑点（Ⅲ，Ⅳ）进行二次层析，可实现在同一薄层板上有效分离4种高异黄烷酮成分。

3.3 不同产地玉竹质量分析

20批玉竹中有7批未检出高异黄烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ。根据TLC点样量、LOD及供试品溶液取样量进行推算，每1 g玉竹中高异黄烷酮Ⅰ及Ⅲ的含量低于6 μg，高异黄烷酮Ⅳ及Ⅴ的含量低于3 μg时，即不能用本研究中的方法检出。故该方法实质是对4种高异黄烷酮进行限量控制的基本方法，可对不同产地玉竹质量进行初步评价。20批玉竹中，13批检出高异黄烷酮Ⅲ及Ⅳ。该成分不仅具有抗癌活性，且在TLC中斑点颜色明显深于高异黄烷酮Ⅰ及Ⅴ；经UPLC验证，高异黄烷酮Ⅲ及Ⅳ的含量是高异黄烷酮Ⅰ及Ⅴ的3～5倍，现有玉竹质量标准可增设Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ的TLC鉴别与Ⅲ及Ⅳ的含量测定方法。

综上所述，本研究中依据2015年版《中国药典（一部）》，分别对20批市售玉竹进行了检验，其灵敏度、专属性强，结果均符合规定，但7批未检出高异黄烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ的玉竹中多糖含量明显高于13批检出高异黄烷酮Ⅲ及Ⅳ的玉竹。这种成分差异很可能会导致不同产地玉竹的疗效与保健功能的不同，希望能引起关注，进一步研究不同产地玉竹药理作用与保健功能的异同。