Tim-3在早期自然流产中的作用及与Th17/Treg细胞的关系

李雪莲，丁华，姜忠训，方渝，初晓丽，李延东，张大微，戴婉波

(1.广州医科大学附属深圳沙井医院产科，2.检验科，3.病理科，广东 深圳 518104)

早期自然流产是临床常见的妊娠不良结局，妊娠期间母体通常对胚胎表现为生理性免疫耐受状态，若发生免疫耐受失衡，则可造成流产[1-2]。既往普遍认为，Th1/Th2失衡与早期自然流产密切相关。近年来研究显示，Th17/Treg细胞在早期自然流产中同样具有重要作用。T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子-3(T cell immunoglobulin mucin-3，Tim-3)在抗原递呈细胞、T细胞激活、增殖、分化、凋亡过程中具有调控作用，其信号激活可导致Th1、Th17型免疫反应下调，进而加快Treg分化[3]。同时，Tim-3还可能介导相关细胞因子白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、IL-17、转化生长因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)改变，抑制免疫应答，在免疫耐受形成、维持中发挥重要作用。而Tim-3与Th17/Treg的相关性、Tim-3/Th17/Treg细胞模式在早期自然流产发生中的作用研究较少。本研究选取我院妇科门诊早期自然流产患者、同期正常早孕自愿行人工流产者进行分组对比，以探讨Tim-3在早期自然流产中的作用及与Th17/Treg细胞的关系，为Tim-3/Th17/Treg细胞模式解释早期自然流产患者母胎界面免疫耐受机制是否合理提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年12月至2017年3月我院妇科门诊收治的30例早期自然流产患者作为研究组，年龄20～35岁，平均年龄(26.30±4.03)岁；孕周5～10周，平均孕周(7.63±0.22)周。另选取同期30例正常早孕自愿行人工流产者作为对照组，年龄19～34岁，平均年龄(26.17±3.93)岁；孕周5～9周，平均孕周(6.63±0.16)。均排除解剖异常如宫腔占位等；有害化学物质、放射线接触史者；孕早期发热、服药者；酗酒、吸烟等不良习惯者；存在内外科合并症和或并发症者；属于近亲婚配者。两组一般资料比较，差异无统计学意义(P<0.05)，具有可比性。

1.2 主要实验设备与试剂

1.2.1主要实验仪器 美国C6型流式细胞仪、日本4000型台式离心机、LEICA显微镜、芬兰ASCENT 酶标比色仪、恒温冰箱等。

1.2.2主要试剂和耗材 Ionomycin、PMA、Brefeldin A、Anti-Human-CD25-PE-Cyanine7、Anti human CD4-FITC、Anti-Human IL-17A-PE、Anti-Human TIM3-APC、Tim-3、IL-6、IL-17、TGF-β酶联免疫吸附试剂盒和免疫组化试剂盒。

1.3 研究方法

所有受检者抽取6 mL静脉血，3 mL置入肝素钠抗凝管用于流式细胞检测；3 mL放入干燥无菌EP管中离心后取血清-80℃保存,统一待测。取清宫后的蜕膜组织，立即用生理盐水洗净，10%福尔马林固定24～48 h，石蜡包埋，统一切片待测。

1.3.1CD4+T Tim-3检测 将100 μL新鲜EDTA抗凝外周血分别加入2支流式管，加入CD4-FITC、APC-CD3、PE-Tim-3抗体，避光孵育后加入红细胞裂解液，破膜后避光孵育，PBS缓冲液洗涤，给予PBS(500 μL)重悬，采用流式细胞仪检测CD4+细胞中CD4+Tim-3，并设立同型对照。

1.3.2CD4+T Treg Tim-3 采用淋巴细胞分离液(Ficoll)分离外周血单核细胞，洗涤后，加入CD4-FITC，CD25-PE-Cyanine7，TIM3-APC，避光孵育，加入破膜剂破膜，再次避光孵育后离心洗涤，重悬细胞，采用流式细胞仪检测CD4+细胞中CD4+CD25+Treg+Tim-3细胞所占比例，同时设立同型对照。

1.3.3CD4+T Th17 Tim-3检测方法 将外周血单核细胞分离后进行洗涤、避光孵育，离心后加入TIM3-APC、CD4-FITC，加入破膜剂破膜后再次避光孵育，再将IL-17A-PE单抗加入，于4 ℃避光条件下孵育，时间为15 min，洗涤后重悬细胞，采用流式细胞仪检测CD4+细胞中CD4+Th17+Tim-3细胞所占比例，同时设立同型对照。

1.3.4相关细胞因子检测方法 外周血中Tim-3、IL-6、IL-17、TGF-β水平采用酶联免疫吸附法检测，子宫蜕膜中Tim-3、IL-6、IL-17、TGF-β的表达采用免疫组织化学法检测。

1.4 观察指标

(1)两组PBMC中CD4+T Tim-3、CD4+T Th17 Tim-3、CD4+T Treg Tim-3的表达水平及Th17/Treg Ratio；(2)Tim-3与Th17/Treg细胞相关性；(3)两组外周血Tim-3、IL-6、IL-17、TGF-β的表达水平；(4)两组子宫蜕膜Tim-3、IL-6、IL-17、TGF-β阳性表达率。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 外周血单核细胞中CD4+T Tim-3、CD4+T Th17 Tim-3、CD4+T Treg Tim-3、Th17/Treg Ratio的表达

研究组外周血单核细胞中CD4+T Treg Tim-3低于对照组，CD4+T Tim-3、CD4+T Th17 Tim-3、Th17/Treg Ratio高于对照组(P<0.05)，见表1。

2.2 Tim-3的表达与Th17/Treg细胞相关性

研究组Tim-3表达与Th17/Treg细胞呈正相关(r=0.898，P<0.05)。

2.3 外周血Tim-3、IL-6、IL-17、TGF-β水平

研究组外周血Tim-3、IL-6、IL-17、TGF-β高于对照组(P<0.05)，见表2。

组别CD4+T Tim-3(%)CD4+T Th17 Tim-3(%)CD4+T Treg Tim-3(%)Th17/Treg Ratio研究组5.22±1.432.74±1.021.27±0.691.46±0.65对照组1.39±0.691.30±0.573.00±0.811.04±0.54t值13.246.752.322.76P值<0.05<0.05<0.05<0.05

表2 两组外周血Tim-3、IL-6、IL-17、TGF-β水平比较[M(Q1，Q3)，pg/ml，n=30]

2.4 子宫蜕膜Tim-3、IL-6、IL-17、TGF-β阳性表达率

研究组子宫蜕膜Tim-3、IL-6、IL-17阳性表达率高于对照组(P<0.05)；两组子宫蜕膜中TGF-β阳性表达率无明显差异(P<0.05)，见表3。

表3 两组子宫蜕膜Tim-3、IL-6、IL-17、TGF-β阳性表达率比较[n(%)，n=30]

3 讨 论

自然流产属于妇产科常见的妊娠并发症，免疫学理论认为，妊娠属于同种半异体移植过程，其正常维持需依靠母体免疫耐受携带父系抗原的胎儿，若母胎间免疫失衡，则极易造成自然流产等不良妊娠结局[4]。

Th17、Treg细胞来源于共同祖细胞，两者可于不同因子作用下由T细胞分化成Th17、Treg细胞。Th17细胞可诱导发生炎症、自身免疫性疾病等，对妊娠造成不良影响，而Treg则可通过免疫应答保护胎儿组织。同时，相关研究表明，Th17细胞可通过增加产生IL-17发挥抑制Treg细胞增殖作用[5]。近年来，Th17/Treg亚群平衡状态在妊娠维持中的作用受到临床关注。动物实验及临床研究证实，与妊娠前相比，妊娠小鼠及人类母胎界面Treg表达呈现明显升高趋势，Th17/Treg亚群逐渐偏移向Treg，表明Th17/Treg在妊娠期间维持母胎免疫耐受中具有重要作用[6]。以往临床针对早期自然流产通常以Th1/Th2模式来解释，而Tim-3在免疫失衡及其相关细胞因子改变、Tim-3/Th17/Treg细胞模式在早期自然流产中的作用研究较少。Tim-3属于Th1相关的负性共刺激因子，是一种Ⅰ型膜蛋白，可调控T细胞分化、增殖、凋亡，还可作为重要免疫调节分子，在免疫反应、免疫耐受中具有关键性作用，不仅可参与T细胞免疫应答，且于CD4+T细胞上呈现表达异常时与多种病毒感染、自身免疫性疾病等密切相关，而CD4+T细胞有不同的细胞亚型，其中包括Th17、Treg细胞亚型[7-8]。同时，相关研究显示，Tim-3可通过结合配体，于Th17、Treg细胞上表达，抑制其分化，加速凋亡，最终导致免疫应答下调[9-10]。

CD4+CD25+Treg属于Treg特异性标志，IL-17是由Th17细胞特异性分泌。因此，本研究试验中采用流式细胞仪检测CD4+IL-17、CD4+CD25+Treg水平，分别代表Th17、Treg细胞水平，结果表明，研究组PBMC中CD4+T Treg Tim-3低于对照组，CD4+T Tim-3、CD4+T Th17 Tim-3、Th17/Treg Ratio高于对照组，且研究组Tim-3表达与Th17/Treg细胞呈正相关(P<0.05)，可见早期自然流产中Tim-3呈现异常表达状态，与Th17/Treg平衡偏移方向一致，且与Th17/Treg Ratio呈正相关。Th17细胞具有诱导粒细胞集落刺激因子、免疫炎症细胞因子等表达的作用，且可与炎性因子发挥协同作用，导致炎性效应增强，加快炎症及免疫排斥反应过程进展；Treg则具有诱导机体免疫耐受作用，可诱导分泌IL-6、TGF-β[11-12]。本研究为进一步明确Tim-3与Th17、Treg细胞相关细胞因子在早期自然流产中的作用，分析了早期自然流产者与正常早孕自愿行人工流产者外周血及子宫蜕膜Tim-3、IL-6、IL-17、TGF-β水平。数据显示，研究组外周血Tim-3、IL-6、IL-17、TGF-β高于对照组，子宫蜕膜中Tim-3、IL-6、IL-17阳性表达率高于对照组(P<0.05)，分析其原因，Tim-3信号通路可参与抗原特异性CD4+CD25+Treg生成及其免疫抑制功能，其表达异常时可减少Treg细胞数量，从而造成Th17/Treg失衡，减弱抑制CD4+T细胞增殖作用，进而破坏母胎界面免疫调控网络平衡，最终导致胚胎丢失。由此可见，Tim-3不仅与Th17/Treg Ratio呈正相关，还可介导Th17、Treg相关细胞因子改变，在早期自然流产中可能发挥着重要作用。随着不断深入研究，Tim-3有望成为早期自然流产的特异性指标。同时，以往的研究发明，Tim-3可特异性表达于Th1细胞，且Th17/Treg细胞失衡可产生大量Th1型细胞因子。因此与Th1/Th2细胞模式相比，Tim-3/Th17/Treg细胞模式在解释早期自然流产患者母胎界面免疫耐受机制方面可能更为精准，为早期自然流产发生机制提供较为可靠依据。

综上所述，Tim-3在早期自然流产中呈现异常表达状态，与Th17/Treg Ratio呈正相关，与Th17/Treg细胞失衡、相关细胞因子改变密切相关。通过检测Tim-3水平，可能有助于临床及时判断早期自然流产发生及进展情况，可为临床治疗提供理论依据，以便制定合理治疗方案。