基于cell-SELEX技术筛选高转移胃癌细胞系HGC-27核酸适配体

刘 涛，王进军，方晓娜，何 磊，杨伟丽，罗昭锋，王亚雷

胃癌是消化系统的常见的恶性肿瘤，转移与侵袭是患者死亡的主要原因。大约50%患者在胃癌确诊时已经发生了转移[1]。由于胃癌主要通过淋巴结转移[2]，因此及时准确的判断有无淋巴结转移对于胃癌的治疗方式选择及预后评价至关重要。CT及MRI是目前临床上判断胃癌是否发生转移最常用的检测手段。然而，这种诊断方法主要根据病变部位形态学特征，不能从分子水平早期判断是否发生转移。核酸适配体(aptamer)是一类人工合成的短链单链DNA或者RNA，可以与靶标特定结构结合产生类似“抗原-抗体”反应，故又称之为“化学抗体”。因此，该研究利用目前常用的细胞-配体指数富集系统进化[3](systematic evolution of ligands by exponential enrichment，Cell-SELEX) 技术筛选特异性识别高转移性胃癌细胞株的核酸适配体，为胃癌早期转移的分子诊断提供基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1细胞系 人胃癌细胞株HGC-27(高转移能力)，AGS(无转移能力)购自中国科学院上海细胞库；肺癌细胞A549、肝癌细胞Hep3B及HepG2、结肠癌细胞SW480、乳腺癌细胞MCF-7，均为本实验室保存；人胚肾细胞HEK-293为中国科学技术大学生命科学院惠赠；实验所用细胞均处于对数期。

1.1.2随机DNA文库及引物 随机单链DNA文库(5′-TTCAGCACTCCACGCATAGC-N40-CCTATGCGTG-CTACCGTGAA-3′)，引物：5′-FAM- TTCAGCACTCCACGCATAGC-3′(上游荧光素标记引物)、5′-18A-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3′(上游18个碱基A加长标记引物)由上海生工生物工程公司合成。

1.1.3主要试剂 Q5高保真DNA聚合酶(英国NEB公司)；PMI-1640及DMEM培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco’s)、酵母tRNA购自美国Sigma公司；葡萄糖以及BSA购自上海生工生物工程公司；无酶消化液(北京普利莱基因技术有限公司)；EM90矿物油由中国科学技术大学生命科学院配置并提供。洗涤缓冲液以及结合缓冲液由实验室自行配置：洗涤缓冲液(含4.5 g/L葡萄糖及5 mmol/L MgCl2的杜氏磷酸盐缓冲液)；结合缓冲液(含有0.1 mg/ml酵母tRNA和1 mg/ml BSA的洗涤缓冲液)。其他试剂均为国产分析纯,实验用水为过滤除菌的超纯水。

1.1.4主要实验仪器 Guava easyCyte 5流式细胞仪(美国Merck Millipore公司)；ABI 7500 PCR扩增仪(美国Thermo公司)；CLM-170B-8-NF型CO2培养箱(上海Esco公司)。

1.2 方法参照文献[4]采用Cell-SELEX技术。

1.2.1核酸适配体筛选

1.2.1.1文库处理 单链DNA文库1.3 nmol溶解于1.3 ml洗涤缓冲液中，95 ℃变性10 min,冰浴10 min后,加入200 μl结合缓冲液。

1.2.1.2消减筛选 将预处理文库与HGC-27细胞在4 ℃振荡孵育120 min,去上清液,加入2 ml洗涤缓冲液,洗涤2次。加入200 μl超纯水(ddH2O),用细胞刮刀将细胞转移至离心管。100 ℃热变性10 min,收集与HGC-27结合的单链DNA(ssDNA)。

1.2.2亚文库制备 将ssDNA与配置含有FAM修饰及碱基A加长的引物的PCR扩增体系涡旋混合，然后加入6 ml EM90 矿物油振荡混匀，PCR扩增,98 ℃变性3 min,进行15～25个循环,98 ℃变性10 s,68 ℃复性20 s, 72 ℃延伸20 s,最后72 ℃延伸3 min。PCR产物加入16 ml正丁醇振荡混匀，9 000 r/min、10 min。弃上清液，沉淀物利用8%变性PAGE胶电泳分离、浓缩得到ssDNA文库。从第5轮开始先将上一轮ssDNA文库与AGS细胞孵育 30～60 min, 上层清液用于正筛。

1.2.3高特异性及亲和力次级文库 为了提高筛选所得核酸适配体的亲和力和特异性,在筛选过程中改变部分筛选条件, 反筛选的孵育时间由30 min逐渐增加至60 min,正筛选的孵育时间由120 min逐渐减少至60 min,提高正筛选的洗涤强度,包括洗涤次数和时间、洗涤液的体积,并在孵育过程中加入胎牛血清以降低非特异性结合。

1.2.4文库富集程度分析 用流式细胞术监测ssDNA文库中核酸适配体的富集程度.PBS洗涤靶细胞HGC-27两次，加入无酶消化液收集靶细胞.将终浓度为200 nmol/L的ssDNA文库与约4×106个靶细胞4 ℃孵育60 min,洗涤缓冲液洗2次后流式细胞仪检测荧光强度,以FAM标记的随机DNA序列做为对照。核酸适配体亲和力测定及细胞特异性考察时采用上述相同的实验操作方法。

1.2.5筛选产物测序及分析 筛选产物的克隆和测序。经过11轮的筛选后,产物用不带标记的引物进行PCR扩增后,由天津诺禾致源生物信息科技公司进行高通量测序工作。用Clustal X软件进行序列同源性比对，从每个家族中挑出序列富集度最高进行FAM荧光修饰合成并进行亲和力鉴定。

1.2.6核酸适配体与靶标亲和力分析 平行设置6个浓度梯度(50、100、200、300、 400、500 nmol/L)的核酸适配体样品(重复3次)与靶细胞孵育,根据Y=Bmax X/(Kd+X)方程，用GraphPad Prism软件分析饱和结合曲线获得解离常数(Kd)。

1.2.7核酸适配体与靶标特异性分析 核酸适配体对靶细胞株的特异性识别能力是其作为特异性分子识别探针的关键。将挑选的核算适配体与胃癌细胞HGC-27、肝癌细胞HepG2、 Hep3B、结肠癌细胞SW480、肺癌细胞A549、乳腺癌细胞MCF-7及人胚肾细胞HEK-293进行结合反应，操作同上，流式细胞术观察荧光强度。

1.2.8核酸适配体与靶标结合位点化学性质初步分析 PBS洗涤靶细胞HGC-27两次，然后分别加入500 μl胰蛋白酶以及无酶消化液，室温消化2 min后迅速加入2 ml PBS(含10% FBS)，终止消化，洗涤。然后按上述操作步骤进行亲和力测定。

2 结果

2.1 高转移胃癌细胞株HGC-27核酸适配体筛选采用流式细胞术监测筛选文库与靶细胞的亲和富集程度, 结果如图1所示。随着筛选轮数的增加,次级文库与靶细胞株HGC-27结合的荧光强度逐渐增加,表明次级文库能与靶细胞株HGC-27结合的核酸适配体逐渐富集; 而次级文库与对照细胞株AGS细胞株荧光强度无明显变化,表明次级文库具有较强特异性。同时,流式细胞术显示第11轮与第9轮荧光强度无明显变化并且达到最大值,因此将筛选文库进行克隆测序。 对次级文库进行PCR扩增，高通量测序。根据测序结果及Clustal X分析，选择的同源性及富集程度最高的7条序列进行化学合成,流式细胞仪分析表明只有一条对靶细胞株HGC-27具有较强结合能力的核酸适配体LW-25。见表1。

图1 不同轮数的筛选产物与细胞结合的流式细胞术测定结果

A：各轮文库与HGC-27细胞株结合荧光强度；B：各轮文库与AGS细胞株结合荧光强度

2.2 核酸适配体的亲和力考察通过Graph-Pad.Prism7.0软件分析得知，LW-25的解离常数(Kd)为121 nmol/L，见图2。表明筛选得到的核酸适配体LW-25与靶细胞株有高的亲和性。

图2 适配体LW-25与HGC-27亲和力分析

2.3 核酸适配体特异性考察利用流式细胞术考察核酸适配体与靶细胞，其他肿瘤细胞系及人HEK-293细胞系的结合情况(核酸适配体终浓度400 nmol/L)。如图3所示,筛选得到的核酸适配体LW-25特异性与靶细胞结合,可以很好地区分识别转移性胃癌细胞与其他类型肿瘤细胞株如乳腺癌、肝癌、结肠癌、肺癌以及HEK-293，表现出对靶细胞株的高度特异性。

2.4 LW-25与HGC-27结合位点化学性质初步分析如图4所示，核酸适配体LW-25与经胰蛋白酶处理后HGC-27细胞株结合荧光强度(蓝色线条)，明显低于其与未经胰蛋白酶处理的同种细胞(红色线条)，表明其结合位点可能为蛋白质。

3 讨论

胃癌是继肺癌之后在全球癌症相关死因中排第2位，其预后与分期密切相关。由于胃癌主要通过淋巴结转移，因此术前准确评估有无淋巴结转移对于胃癌分期以及治疗方式选择至关重要。对于无淋巴结转移的早期胃癌可通过ESD术治疗，对于进展期胃癌可通过外科手术治疗或化疗。目前临床上手术前判断胃癌有无淋巴结转移主要依赖CT,MRI及PET-CT。研究[5]分析表明这些检测技术在诊断胃癌有无淋巴结转移存在一定不足。病理学上常利用连续切片技术，免疫组化以及逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术来检测胃癌是否有早期转移(淋巴结微转移)，然而这些技术存在操作繁琐，准确率较低以及假阳性高等问题[6]。

表1 LW-25与HGC-27细胞株的结合平衡解离常数

图3 核酸适配体LW-25与靶细胞株结合特异性分析

图4 胰蛋白酶处理对LW-25与HGC-27结合荧光强度的影响

核酸适配体是继抗体之后又一类被广泛应用的生物靶向分子，具有很强的亲和力及特异性。2006年谭蔚泓院士课题组率先提出Cell-SELEX技术,通过该技术能在不清楚或不能区分完整细胞上的靶标的情况下,获得一组识别不同细胞的核酸适配体分子探针。其自身能够折叠形成特定的空间结构,通过氢键、疏水作用、范德华力等非共价作用力与靶标特异性、高亲和性结合[7]。其与靶标的结合机制与抗体抗原的作用机制相类似,因此核酸适配体又被称为“化学抗体”。与传统的生物抗体相比，核酸适配体与靶标结合不仅具有较高特异性和亲和力，并且易于快速化学合成、低免疫原性、毒性小，稳定性高，易穿透肿瘤组织，是一类具有重大应用潜能的分子研究工具[8]。

近年来，Cell-SELEX技术被广泛运用于筛选识别肿瘤细胞的分子探针-核酸适配体。Lu et al[9]以肝癌细胞株HepG2为正筛细胞，肝实质细胞HL-7702为反筛细胞，成功筛选出识别特异性识别肝癌细胞HepG2的核酸适配体HA09，并且能够区分肝癌组织与正常组织。Wu et al[10]基于Cell-SELEX技术筛选出核酸适配体XQ-2d不仅能特异性识别胰腺导管癌细胞，而且在鉴别胰腺癌组织与正常胰腺组织上显示出较高的诊断价值。同时XQ-2d能够特异性识别小鼠体内被接种上胰腺导管癌的肿瘤组织。

目前已筛选的胃癌细胞核酸适配体多以AGS或SGC-7901为正筛细胞，胃正常上皮细胞GES-1为反筛细胞，这些核酸适配体只能用于胃癌早期诊断而对于胃癌转移没有诊断价值[11-12]。因此，本研究以高转移胃癌细胞HGC-27为正筛细胞，无转移特性胃癌细胞AGS为反筛细胞，建立了细胞核酸适配体筛选平台，对筛选过程PCR方法进行改进，成功筛选出一条针对高转移胃癌细胞的核酸适配体并且具有较高亲和力及特异性。同时胰蛋白酶消化处理后，LW-25与HGC-27几乎没有结合，初步提示靶标分子可能为蛋白。

在本研究中一些技术环节上的改进，如在Cell-SELEX过程中的扩增环节采用乳化液PCR技术。相对于传统的RCP扩增容易引起偏好扩增以及非特异性扩增，乳化液PCR扩增的优势在于[13]：① 可以把不同的DNA片段分在不同的乳化液颗粒中单独进行PCR 扩增，避免了引物间以及不同种类产物间相互杂交，消除了非特异性产物。② 能消除不同产物间的竞争抑制，避免了传统 PCR 优先扩增短链 DNA片段问题。③ 高通量，能同时扩增多达108个不同的DNA模板，且产物量多于传统PCR。④ 灵敏度高，能把文库中极微量DNA扩增出来，解决了扩增中出现偏好扩增；同时采用高保真Q5扩增酶，能够有效减少实验过程的污染序列对扩增干扰。