云南省临沧地区2009-2014年HIV-1基因型耐药情况分析*

钟 敏，段 勇，何增品，李 娅，左薇薇，杨恒根

(1.昆明医科大学第一附属医院医学检验科，云南昆明 650032；2.云南省实验诊断研究所，云南昆明 650032；3.云南省检验医学重点实验室，云南昆明 650032；4.临沧市人民医院医学检验科，云南临沧 677000)

国家艾滋病(AIDS)免费抗病毒治疗工作在全国深入开展,针对AIDS病毒耐药的研究也长期持续展开，这为了解我国免费抗病毒治疗后人类免疫缺陷病毒(HIV)耐药毒株的发生与流行情况提供了宝贵的资料。目前，临沧是云南省AIDS流行地区之一，截至2014年底，临沧地区累计存活HIV感染者和AIDS患者6 970例,占整个地区总人口的0.29%。为进一步加强临沧地区AIDS的防控工作,本研究对2009年1月1日至2014年12月31日整个临沧地区1 935例经过高效抗逆转录病毒治疗(HAART)后病毒学失败的AIDS患者进行横断面调查,分析这些病毒学失败人群中耐药突变发生情况。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2009-2014年云南省临沧地区接受免费HAART的HIV感染/AIDS患者的治疗信息，筛选出其中抗病毒治疗时间≥6个月、病毒载量≥1 000拷贝/mL的患者的血浆标本进行HIV-1耐药检测[1]。同时，收集HIV感染/AIDS患者的人口学、临床及实验室资料。上述血浆样本保存于-80 ℃低温冰箱，未经过反复冻融。

1.2仪器与试剂

1.2.1血浆RNA提取 采用德国Qiagen公司QIAamp Viral RNAMini Kit试剂盒，从待检血浆中抽提病毒RNA，具体操作见试剂盒说明书。

1.2.2基因型耐药性检测 提取的RNA经逆转录后，用RT-PCR完成对样本靶基因的扩增，即先用一步RT-PCR方法完成逆转录和第1轮PCR，使用大连宝生物公司TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)试剂盒，再以第1轮PCR产物为模板进行第2轮PCR。耐药检测使用引物见表1，耐药检测反应体系及程序参照文献[2]。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，切下目的片段，采用德国Qiagen公司Qi Aamp Gel Extraction Kit 进行回收，回收片段委托北京诺赛基因有限公司进行序列测定。所使用的方法扩增产物长度为1 170 bp，包括蛋白酶基因全长(1～99氨基酸)和逆转录酶基因至少前254个氨基酸(1～254氨基酸)。

表1 基因型耐药性检测及测序引物序列

注：a为测序引物；HXB2为标准参考株

1.3方法 序列拼接与耐药分析：耐药分析应用Contig Express软件拼接原始核苷酸序列，用Bio Edit软件进行拼接后序列的校对、整理和比对分析，整理后序列提交斯坦福HIV药物抗性数据库(Stanford HIV Drug Resistance Database，http://hivdb.stanford.edu)进行耐药突变位点的分析和解释耐药变异情况。

1.4统计学处理 应用SPSS22.0软件对所得到的HIV-1耐药基因突变频率和位点进行统计，计数资料以频数或百分比表示。

2 结 果

2.1研究对象特征 收集2009-2014年云南省临沧地区接受国家免费HAART患者病毒学失败血浆标本共1 935例，其中男性1 156例，女性779例，性别比例为1.5∶1，年龄2～87岁，平均年龄(39.15±9.95)岁。确认时间在2003-2014年，接受HAART的治疗时间为7～105个月，平均治疗时间为35.62个月。病毒载量1 000～487 498拷贝/mL,平均值为(46 782±148) 拷贝/mL。感染方式：性传播1 507例(占77.9%)，静脉药瘾传播362例(占18.7%)，母婴传播8例(占0.4%)，输血传播17例(占0.9%)，其他不详途径传播41例(占2.1%)。使用药物方案均为国家免费AIDS抗病毒药物治疗手册推荐的方案[3]。见表2。

表2 1 935例患者的临床资料

续表2 1 935例患者的临床资料

注：AZT为齐多夫定；D4T为司他夫定；3TC为拉米夫定；NVP为奈韦拉平；EFV为依非韦仑；LPV/r为洛匹那韦/利托那韦；ABC为阿巴卡韦

2.2基因型耐药突变位点情况 共894例患者检测出与耐药相关的突变位点，占抗病毒治疗病毒学失败患者的46.2%(894/1 935)，占抗病毒治疗总体人群的6.6%(894/13 491)。1 935例检测结果中，与蛋白酶类抑制剂(PIs)相关的主要耐药基因突变位点L33F 15例，占0.8%(15/1 935)；与核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)相关的突变中，突变位点发生频率最高的是M184V/I，占23.2%(451/1 935)。与非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)相关的突变中，突变位点发生频率最高的是K103N/S，占19.5%(377/1 935)，其他依次为G190A/S，占7.9%(153/1 935)；Y181C/V，占8.1%(157/1 935)；V179D/E，占7.9%(153/1 935)。见表3。

表3 894例患者耐药突变位点情况

2.3HAART后药物耐药情况 1 935例HAART后病毒学失败患者中，894例患者检测出耐药突变，在使用的NNRTIs药物中对NVP、EFV高度耐药的构成比分别为34.5%、27.1%；核苷类药物中对3TC、AZT、D4T、TDF高度耐药的构成比分别为23.5%、3.5%、3.5%、1.6%，对LPV/r高度耐药的构成比为0.8%。见图1。

2.4各治疗时间耐药突变分析 各治疗时间的耐药突变差异有统计学意义(χ2=108.423，P<0.01),并且随着治疗时间延长,耐药突变有增加的趋势。所有组从治疗6～12个月开始患者已表现出对NRTIs和(或)NNRTIs耐药,并且从治疗49～60个月开始患者对NNRTIs的耐药突变率均超过了50.0%。见表4。

注：ATV/r为阿扎那韦/利托那韦；DRV/r为达芦那韦/利托那韦；FPV/r为福沙那韦/利托那韦；IDV/r为茚地那韦/利托那韦；NFV为奈非那韦；SQV/r为沙奎那韦/利托那韦；TPV/r为替普那韦/利托那韦；DDI为去羟肌苷；FTC为恩曲他滨；TDF为替诺福韦；DLV为地拉夫定；ETR为依曲韦林

图11395例患者药物耐药情况

3 讨 论

截至2014年底，云南省临沧地区自2005年实施免费抗病毒治疗以来，整个地区有11家县级及县级以上医院开展了AIDS抗病毒治疗工作，随着HAART的广泛使用，显著降低了HIV感染者相关疾病的发病率及病死率，提高了HIV感染者生存质量。抗病毒治疗能够有效恢复患者的免疫功能，但治疗中存在一些问题，特别是耐药问题，给深入开展HAART带来严峻挑战[3]。WHO推荐对抗病毒治疗患者实施耐药性监测以提高治疗效果[4]。

本研究结果显示,在平均治疗35个月后，抗病毒治疗病毒学失败的894例患者产生不同程度的耐药，治疗人群的总耐药率为6.6%,病毒学失败人群的耐药率达46.2%。目前，使用的抗病毒治疗方案仍然以2种核苷类抑制剂和1种非核苷类抑制剂为主[5]，核苷类药物是较易使患者产生多重耐药突变从而导致针对多种核苷类药物发生耐药的药物[6-7]。本研究中耐药突变频率较高的是NNRTI(50.6%)和NRTI(32.8%)类耐药，其中NNRTI类耐药突变率与总突变率(46.2%)相近，这与目前使用的一线治疗方案相符。NRTI和NNRTI突变频率最高的位点分别为M184V/I(23.2%)和 K103N/S(19.5%)，与国内其他研究结果一致[8-10]。众所周知,AIDS患者服药依从性的好坏直接影响治疗效果,依从性差的患者不仅达不到有效的治疗效果,还易产生耐药毒株，这与国内其他HAART治疗研究结果相一致[11-13]。本研究中的治疗人群由于地处偏远地区，文化教育程度不高，服药依从性差成为耐药产生的主要原因，在这些治疗人群中有4.0%的患者甚至停药。由于患者体内HIV出现耐药性突变,导致抗病毒药物无法完全抑制体内病毒的复制,而使患者的免疫功能即使在抗病毒治疗实施以后仍然继续遭受破坏,难以取得良好的治疗效果。因此，为达到完全抑制病毒复制的目的,首先必须加强依从性教育,保证良好的服药依从性,以取得预期的抗病毒效果,使免疫功能逐渐得以恢复、重建。其重要性在对患者的随访中已观察到,且随着治疗时间延长,服药依从性教育仍需要反复强调。

随着抗病毒治疗的开展以及治疗时间的延长,由于患者的服药依从性差导致的治疗失败以及随着治疗时间延长,耐药性突变累积的现象有所增加,突变的种类及数量也逐渐增加,出现对现有各类一线药物不同程度的耐药[14-15]。在不同种类和强度的药物选择压力下,HIV-1耐药随着治疗时间逐渐增强,病毒准种的组成和分布始终处于动态变化中。从表4可以看出，临沧地区2009-2014年接受抗病毒治疗病毒学失败人群耐药率随治疗时间的延长呈上升趋势。因此，随着治疗时间的延长，基因耐药突变逐步累积导致耐药率逐渐增高。

4 结 论

临沧地区目前AIDS抗病毒治疗病毒学失败人群耐药基因突变率较高，接受治疗者对逆转录酶抑制剂的耐药率较高，虽然基因型耐药突变并不能表明所耐受的药物已经失去作用,但是随着治疗时间的延长和耐药突变的积累,抗病毒药物最终将失去作用。随着HAART治疗的深入开展，应做好HAART过程中患者服药的管理工作,提高患者的服药依从性并及时进行耐药监测，为抗病毒药物合理选择提供建议,减缓耐药病例的发生，最终提高患者的生存质量。