基质细胞衍生因子-1基因转染对人胃癌细胞株SGC7901增殖、耐药的影响及其机制

刘小慧，贺曼曼，张伟，李静，牛广旭，冯运章

(邯郸市中心医院,河北邯郸 056001)

胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤[1,2]。新辅助化疗、转化治疗或术后辅助化疗均能改善部分患者总体生存期[3]。奥沙利铂以DNA为作用靶点，是目前临床胃癌化疗的一线药物，但其耐药是影响胃癌患者预后的重要因素[4]。基质细胞衍生因子-1(SDF-1)是一类炎性趋化因子，与其受体 CXCR-4广泛地表达于多种细胞和组织中，参与免疫、循环系及中枢神经系统发育等重要生理过程，同时还参与肿瘤细胞生长、侵袭、转移、耐药等病理过程[5，6]。目前有研究[6～8]报道，SDF-1高表达与大肠癌细胞、白血病、肺癌细胞的化疗耐药密切相关。但关于SDF-1对胃癌细胞耐药的影响鲜有报道。胃癌耐药机制涉及多方面，而上皮—间质转化(EMT)[9]及细胞自噬[4]均是耐药的重要机制。2018年2～7月，我们观察了SDF-1过表达对人胃癌细胞株SGC7901增殖、耐药的影响，并探讨其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 人胃癌细胞株SGC7901由河北省人民医院科研中心保存并惠赠，常规使用10%胎牛血清、RPMI-1640培养基培养，置于5% CO2、37 ℃恒培箱培养,常规换液传代。转染试剂盒Lipofectamine-2000、TRIzol Reagent(美国 Invitrogen 公司)；cDNA 合成试剂盒(美国Fermentas公司)；MTT试剂盒(南京KGA公司)。实验相关PCR引物由上海生物工程有限公司合成；真核表达载体pcDNA3.1-SDF-1由上海吉玛制药有限公司合成并测序验证。

1.2 SGC7901 细胞分组及pcDNA3.1-SDF-1转染 取对数生长期 SGC7901 细胞分为实验组、阴性对照组、空白对照组， 按1×105的密度接种于6孔板培养，融合度达约80%时实验组、阴性对照组分别转染pcDNA3.1-SDF-1质粒、pcDNA3.1质粒(空白质粒)，将稀释质粒与Lipofectamine 2000混合均匀加入培养孔，室温孵育20 min，所有操作均严格按说明书操作。空白对照组不做任何处理。

1.3 三组细胞 SDF-1 mRNA及蛋白检测 ①采用RT-PCR法检测三组细胞SDF-1 mRNA。质粒转染48 h时，按2×107收集对数生长期三组细胞，TRIzol法提取细胞总RNA，按试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，配置25 μL 反应体系扩增目的基因。引物序列为SDF-1(270 bp)上游引物5′-GGGTACC-ATGCAGCTTGTTG-3′；下游引物5′-GAGATCTCTAG-GCGCCCTGG-3′。GAPDH(258 bp)上游引物5′- AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′；下游引物5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。RT-PCR反应条件：预变性94 ℃ 5 min→94 ℃变性30 s→(SDF-1，55 ℃；GAPDH，58 ℃)退火60 s→72 ℃延伸1 min,扩增30个循环。以GAPDH为内参，以2-ΔΔCt代表CG5844基因的相对表达量。实验重复5次，取平均值。②采用Western bloting法检测细胞SDF-1蛋白。质粒转染48 h时分别收集各组2×107个细胞提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，50 μg蛋白上样，经SDS-PAGE电泳分离，转PVDF膜。洗膜后用红外荧光扫描成像系统扫描，以GAPDH作为内参测算SDF-1蛋白相对表达强度。实验重复5次，取平均值。

1.4 三组细胞增殖情况观察 采用MTT法。 取对数生长期三组细胞接种于96孔板，按5×103/mL调整每孔细胞密度，质粒转染24、48、72、96 h时，加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL作用4 h弃去培养基，加入150 μL的DMSO摇匀，酶标仪测各孔570 nm波长光密度OD值,以OD值代表各组细胞增殖能力。实验重复5次，取平均值。

1.5 三组细胞对奥沙利铂的耐药性观察 MTT法检测细胞对奥沙利铂的耐药性。质粒转染48 h时各取三组对数生长期细胞约2×104个，培养于96孔板，培养24 h后分别按照奥沙利铂(1、2.5、5、10、20、40、80 μg/mL)浓度梯度加药，每种浓度设3个复孔，培养48 h时每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，37 ℃培养4 h，弃上清, 加150 μL 的DMSO摇匀，酶标仪测各孔570 nm波长光密度OD值，测算各组细胞增殖抑制率，SPSS软件进一步测算奥沙利铂对各组细胞的IC50值。实验重复5次，取平均值。

1.6 三组细胞凋亡情况观察 采用流式细胞仪。质粒转染48 h时分别取三组对数生长期细胞，加入10 μg/mL奥沙利铂处理细胞48 h，收集细胞，采用Annexin V-FITC/PI双染法，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL的 PI混合均匀，所有操作均严格按照说明书进行。采用流式细胞仪测算三组凋亡细胞百分率。实验重复5次，取平均值。

1.7 三组细胞EMT相关蛋白上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)及皮型蛋白(Vimentin)检测 采用Western blotting法。质粒转染48 h时取三组细胞，所有操作同“1.3”。使用Image J软件对荧光强度进行定量分析,以GAPDH作为内参测算E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白相对表达强度。实验重复5次，取平均值。将空白对照组及实验组SGC7901细胞收集接种至24孔板，常规培养，倒置显微镜动态观察细胞形态变化。

1.8 三组细胞微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)、白噬相关因子(Beclin 1)蛋白检测 采用Western bloting法。质粒转染48 h时取三组细胞，具体步骤同“1.3”。实验重复5次，取平均值。 透射电镜观察细胞自噬现象：用奥沙利铂(10 μg/mL)分别处理空白对照组及实验组细胞24 h后，收集1×106个细胞，2.5%戊二醛及1%锇酸顺序固定2h，按丙酮梯度脱水，然后包埋、固定、制超薄切片，用5%醋酸铀和柠檬酸铅染色，透射电镜观察细胞自噬现象。

2 结果

2.1 三组细胞SDF-1 mRNA及蛋白相对表达量比较 质粒转染48 h时实验组、空白对照组、阴性对照组细胞SDF-1 mRNA相对表达量分别为2.139±0.170、0.753±0.065、0.764±0.064，与空白对照组、阴性对照组比较，实验组细胞SDF-1 mRNA相对表达量升高(P均<0.05)；培养48 h时实验组、空白对照组、阴性对照组细胞SDF-1 蛋白相对表达量分别为3.557±0.234、1.255±0.081、1.309±0.094，与空白对照组、阴性对照组比较，实验组细胞SDF-1 mRNA相对表达量升高(P均<0.05)。

2.2 三组细胞OD值比较 培养24、48、72 、96 h时三组细胞OD值比较见表1。与空白对照组、阴性对照组比较，培养24、48、72、96 h实验组细胞OD值均升高(P均<0.05)。

表1 培养24、48、72、96 h时三组细胞OD值比较

2.3 奥沙利铂对三组细胞的IC50值比较 不同浓度奥沙利铂作用下三组细胞增殖抑制率比较见表2。 随着奥沙利铂浓度的递增，三组细胞的增殖抑制率均呈递增趋势(P均<0.05)。相同奥沙利铂浓度下，实验组细胞增殖抑制率均明显低于空白及阴性对照组(P均<0.05)。奥沙利铂对实验组、空白对照组、阴性对照组细胞的IC50值分别为28.039±3.011、10.403±1.253、10.612±1.044，与空白对照组、阴性对照组比较，奥沙利铂对实验组细胞的IC50值升高(P均<0.05)。

2.4 三组细胞凋亡率比较 质粒转染48 h时实验组、空白对照组、阴性对照组细胞凋亡率分别为39.10%±2.26%、53.90%±3.19%、51.30%±3.37%，与空白对照组、阴性对照组比较，实验组细胞凋亡率降低(P均<0.05)。

2.5 三组细胞E-cadherin、N-cadherin及Vimentin相对表达量比较 倒置显微镜下动态观察细胞形态变化，空白对照组细胞聚集生长，细胞间连接相对紧密，细胞多呈圆形、椭圆形或扁梭形。而随着培养时间延长，实验组细胞聚集或成团生长现象逐渐消失，细胞呈现分散生长趋势，形态逐渐不规则，细胞变细变长，状如长梭形、长条形、三角形等，部分细胞可见细长伪足出现。

表2 不同浓度奥沙利铂作用下三组细胞增殖抑制率比较

质粒转染48 h时实验组、空白对照组、阴性对照组细胞E-cadhein蛋白相对表达量分别为0.351±0.022、0.482±0.039、0.473±0.035，与空白对照组、阴性对照组比较，实验组细胞E-cadhein蛋白相对表达量降低(P均<0.05)；实验组、空白对照组、阴性对照组细胞N-cadhein蛋白相对表达量分别为0.555±0.032、0.314±0.026、0.327±0.025，与空白对照组、阴性对照组比较，实验组细胞N-cadhein蛋白相对表达量升高(P均<0.05)；实验组、空白对照组、阴性对照组细胞 Vimentin蛋白表达量相对表达量分别为0.842±0.064、0.621±0.054、0.619±0.051，与空白对照组、阴性对照组比较，实验组细胞Vimentin蛋白表达量相对表达量升高(P均<0.05)。

2.6 三组细胞LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白相对表达量比较 奥沙利铂作用24 h后透射电镜下观察，空白对照组及实验组细胞均观察到细胞自噬、自噬性死亡现象，但与空白对照组比较，实验组细胞自噬现象更更多，自噬溶酶体数目也明显增多，同时也能够观察到自噬溶酶体内容物降解后遗留的多量空泡、髓样体。

质粒转染48 h时实验组、空白对照组、阴性对照组细胞 LC3-Ⅱ蛋白表达量相对表达量分别为0.720±0.052、0.424±0.029、0.615±0.049，Beclin 1蛋白表达量相对表达量分别为1.114±0.126、0.433±0.031、0.633±0.055，与空白对照组、阴性对照组比较，实验组细胞LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白表达量相对表达量升高(P均<0.05)。

3 讨论

SDF-1基因位于人10号染色体长臂上，全长约267 bp，编码89个氨基酸残基[10]。SDF-1与其受体CXCR4、CXCR7在多种组织和细胞中广泛表达，与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、转移、耐药均密切相关[6,10]。目前许多研究已证实SDF-1在胃癌细胞[10]、宫颈癌细胞[11]、恶性颅咽管瘤[12]、甲状腺乳头状癌[13]等诸多肿瘤的增殖侵袭转移中发挥重要作用，而其机制与PI3K/Akt[10，12]、NF-κB[13]信号通路激活有关。本研究成功建立SDF-1过表达胃癌细胞，MTT结果表明实验组细胞增殖活力明显高于空白及阴性对照组，表明SDF过表达能够明显促进胃癌细胞增殖。

肿瘤多药耐药是化疗主要障碍,如何克服肿瘤耐药是全球研究热点。研究[7]报道SDF-1能够通过诱导ERK磷酸化,上调抗凋亡蛋白Bcl-xL表达进而降低ALL细胞株SUP-B15对阿霉素的敏感性。肿瘤相关成纤维细胞通过分泌SDF-1激活CXCR4,从而提高Bcl-xL的表达来增强肺癌A549细胞对顺铂的耐药性[8]。本研究结果表明SDF-1过表达能够明显增加胃癌SGC7901细胞对奥沙利铂的耐药性，其耐药倍数较空白及阴性对照组分别增加约2.7、2.6倍。

EMT是指上皮细胞向间质细胞转化的病理过程，这一过程涉及上皮标志物E-cadherin表达下调以及间皮标志物N-cadherin、Vimentin表达上调[14]。目前研究[9]已表明EMT不仅参与肿瘤细胞侵袭转移过程，也是许多肿瘤细胞耐药的一种新的重要机制。肿瘤细胞在产生获得性耐药的过程中有间质化趋势，而具有间质分化状态的肿瘤细胞也常表现为原发性耐药的特点。研究[6，13,15]表明,SDF-1对肿瘤细胞EMT具有正向促进作用。因此本实验推测SDF-1介导耐药可能与EMT有关。为验证上述推论，本实验对EMT相关重要蛋白进行检测，结果表明与对照组相比，实验组E-cadherin蛋白表达下调而N-cadherin、Vimentin表达上调。对细胞形态学的动态观察也发现实验组细胞在生长过程中形态逐渐变得不规则，细胞分散生长，变细变长，细胞形态多见长梭形、长条形、三角形，部分细胞可见细长伪足形成。文俏程等[16]等认为细胞上述形态改变即属于EMT现象。由此本实验认为SDF-1有可能通过促进EMT进程介导胃癌细胞对奥沙利铂耐药。

自噬是真核生物广泛存在的高度保守代谢调控过程，细胞通过溶酶体降解自身受损细胞器和大分子物质以维持细胞代谢平衡和内环境稳态[17]。但细胞自噬是一把双刃剑：一方面机体出现感染、缺氧等应激刺激时，自噬能保护细胞存活；另一方面如果应激持续时间过久，则会出现细胞自噬性死亡[18]。研究表明SDF-1/CXCR4轴能够通过上调miR-125b的表达增强细胞自噬从而介导大肠癌细胞对5-氟尿嘧啶耐药[6]，抑制SDF-1表达能够降低宫颈癌Hela细胞对放疗的抵抗性，诱导其凋亡[19]。由此可见在多数肿瘤细胞中自噬是肿瘤细胞对周围恶劣微环境的一种适应性变化，能够保护肿瘤细胞抵抗化疗、放疗、靶向治疗等诱导的凋亡，是肿瘤发生耐药的机制之一[4]。为验证上述推论，本研究结果表明实验组细胞凋亡率明显低于空白及阴性对照组，透射电镜下观察也发现实验组细胞自噬溶酶体明显高于空白对照组，这意味着SDF-1过表达可能通过诱导胃癌细胞保护性自噬进而抑制细胞凋亡，从而参与胃癌细胞对奥沙利铂的耐药性产生。目前对自噬现象的观察主要通过透射电镜观察细胞形态及检测自噬相关蛋白的表达。LC3是自噬标志物，存在两种形式：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ，自噬发生时LC3-Ⅰ甘氨酸残基能够与自噬泡内膜磷脂酰乙醇胺结合转变为LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ含量可反映细胞自噬活性[4,18,20]。Beclin 1蛋白也是自噬必需的分子，与相应受体PI3K3C 结合成Beclin 1/PI3K3C复合物激活细胞自噬调节通路，参与细胞自噬过程[20]。本研究实验组LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白表达明显增加，证实SDF-1过表达诱导了胃癌细胞自噬以抵御化疗损伤。因此,SDF-1过表达可能部分通过增加胃癌细胞自噬、抑制其凋亡进而参与对奥沙利铂的获得性耐药。研究[21]发现抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路能够促进胃癌细胞发生保护性自噬，而SDF-1能够对PI3K/Akt通路进行调控。

综上所述，SDF-1过表达能够促进SGC7901细胞的增殖，可显著提高SGC7901细胞对奥沙利铂的耐药性，其机制可能与其促进EMT进程以及诱导胃癌细胞自噬增加进而抑制细胞凋亡有关。