黄芪甲苷对柯萨奇B组3型病毒感染乳鼠心肌细胞及病毒性心肌炎乳鼠心肌细胞的修复作用观察

杨秀华，肖云峰，刘天龙，刘小玲，张勇，杨宏昕，刘小雷

(1内蒙古医科大学药学院，呼和浩特010110；2呼伦贝尔职业技术学院；3内蒙古医科大学附属医院;4内蒙古自治区人民医院)

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是最常见的感染性心肌炎。引起VMC的病毒主要是肠道病毒和上呼吸道感染病毒，其中以柯萨奇B组3型病毒(CVB3)最为常见[1]。近年来，VMC的发病率呈上升趋势，尤其是儿童、青壮年发病率较高，发病初期常见发热、全身酸痛、胸痛、疲倦等一般病毒感染症状，因此常因误诊不被患者所重视而延误病情[2]，严重VMC感染可导致心力衰竭、心源性休克甚至猝死。乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸磷酸激酶(CK-MB)是诊断VMC的标志性心肌酶。目前VMC的临床治疗主要以对症治疗、提高机体的免疫力及抗病毒治疗为主[3]，目前尚无统一安全有效的抗VMC药物。黄芪甲苷(AsⅣ)是从蒙古黄芪根茎中提取分离的主要活性成分，具有补气升阳、益卫固表、托毒生肌、利水消肿等功效。黄芪具有增强免疫、强心降压、降血糖、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等功效，可用于冠心病、心绞痛等疾病的治疗[3]。目前关于AsⅣ治疗VMC的效果相关报道较少。2017年9月～2018年6月，我们分别观察了AsⅣ对CVB3感染的乳鼠心肌细胞及VMC乳鼠心肌细胞的保护作用，并分析其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、药物及仪器 SPF级新生1～3 d SD乳鼠，由内蒙古大学实验动物中心提供，许可证编号：SCXK(蒙)2002-0001；SPF级昆明种雄性小鼠75只，体质量18～22 g，由内蒙古大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(蒙)2002-0001。人宫颈癌Hela细胞株由军事医学科学院杨秉呼博士惠赠，Vero细胞株由中国预防医学科学院病毒研究所惠赠；CVB3(Nancy)毒株由中国医学科学院病毒所惠赠；AsⅣ(110781，中国药品生物制品检定所)；LDH测定试剂盒(142715003，南京建成生物工程研究所)；CK-MB试剂盒(14271500，南京建成生物工程研究所)。

1.2 AsⅣ对CVB3感染的乳鼠心肌细胞的保护作用观察

1.2.1 CVB3病毒扩增及病毒滴度(TCID50)检测 ①CVB3病毒扩增[4]取Hela细胞株培养于25 cm2培养瓶中，当长成单层细胞时加入1 mL CVB3病毒液，吸附1 h后弃上清，加5 mL全DMEM培养基，在孵箱中培养。于倒置显微镜下观察细胞形态，当细胞变为单个细胞并发生部分破裂时，终止培养。反复冻融3次，最终完全释放病毒颗粒时移入离心管，1 500 rpm离心15 min，收集上清液，-20 ℃保存备用。②TCID50[5]检测 取Vero细胞用全DMEM培养基将病毒液稀释，浓度范围为10-1～10-8稀释度。将已长成单层细胞的培养液弃去，接种不同浓度的病毒液，记录细胞病变(CPE)的孔数，以CPE达“++”以上为阳性，以最高稀释度不再出现CPE为终点；用 Reed-Muench 法计算 TCID50，得CVB3病毒的TCID50为6.76，即能够使50%细胞发生CPE的病毒浓度为10～76 /mL，最终选择1 000 TCID50作为正式实验的接种浓度。

1.2.2 原代乳鼠心肌细胞分离与培养[6]取新生1～3d SD乳鼠，75%乙醇消毒，迅速剪取心脏心尖处，将心脏均匀剪成约1 mm3的组织块，弃上清。加入6 mL 0.1% 胰酶轻轻吹打，37 ℃消化6 min。加入5 mL 0.08%胰酶及0.05% Ⅱ型胶原酶的混合液，37 ℃消化5 min，吸取上清液转移至另一预冷玻璃瓶中，5 mL的10% DMEM/F12培养基终止消化，重复上述步骤，共消化10次。200目筛网去除大量组织，1000 rpm离心8 min，20% DMEM/F12培养基重悬细胞，37 ℃、5% CO2孵箱中培养，差速贴壁60 min，将细胞悬液转移至另一培养瓶中，继续培养，细胞达到融合状态时开始后续实验。倒置显微镜下可见培养48 h时细胞基本全部贴壁，细胞呈圆形、梭形及多角形，大多数都已伸出伪足，边界清晰可见，并且有自发性节律性搏动；培养72 h细胞伸出伪足并相互触及交织成网，逐渐形成细胞簇，并且同步搏动，搏动频率60～90次/min；培养5～7日细胞搏动频率逐渐达到高峰(110次/min)。α-actin免疫组化染色后乳鼠心肌细胞染色为阳性，胞质内存有棕黄色丝状物质，细胞纯度达95%以上。

1.2.3 AsⅣ对乳鼠心肌细胞的最大无毒浓度(TC0)测算 取乳鼠心肌细胞分为正常对照、AsⅣ(浓度分别为320、160、80、40、20 mg/L),每组每个浓度3个复孔。分别将不同浓度药物加入到已长成单层细胞的96孔板中，37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h，高浓度AsⅣ对细胞的毒性较大，表现为细胞形态发生改变，出现脱落、死亡；随着AsⅣ浓度的降低，对心肌细胞的毒性反应也逐渐减弱。当AsⅣ达到无毒浓度时，给药的细胞和正常对照细胞的CPE没有明显的区别。显微镜下记数CPE的孔数，当不再变化时，用 Reed-Muench 法测算AsⅣ的TD50为40 mg/L，TC0为20 mg/L。

1.2.4 加入AsⅣ的CVB3感染心肌细胞存活情况观察及细胞上清液中LDH、CK-MB检测 取乳鼠心肌细胞分为正常对照组、病毒对照组、AsⅣ组。将密度为5×105/mL的心肌细胞接种于96孔板中，37 ℃，5% CO2孵箱内培养24 h，病毒对照组和AsⅣ组分别用1 000 TCID50的病毒感染心肌细胞，共培养1 h弃去含有病毒的培养液。AsⅣ组分为五个亚组，分别加入20、10、5、2.5、1.25 mg/L的AsⅣ，显微镜下每日观察CPE。当病毒对照组中75%以上的细胞出现病变时结束培养。每孔加入MTT液(0.5 mg/mL)20 μL，培养4 h，吸弃原培养液，每孔加入DMSO 100 μL,振摇5 min，于酶标仪490 nm处读取光密度值(OD值)，根据每组细胞的OD值计算细胞存活率，实验重复3次，取平均值；收集各组细胞上清液，采用全自动生化分析仪对处理样本进行检测，检测指标为LDH、CK-MB，实验重复3次，取平均值。

1.3 AsⅣ对VMC小鼠心脏的保护作用观察

1.3.1 小鼠分组及AsⅣ给药方法 采用随机数字表法将75只小鼠分为正常对照组、模型对照组、AsⅣ高剂量组、AsⅣ中剂量组、AsⅣ低剂量组，每组15只。除正常对照组外，其余各组小鼠均腹腔注射1 000 TCID50 CVB3病毒液0.1 mL/只，建立VMC动物模型。小鼠接种病毒24 h时，AsⅣ高、中、低剂量组分别给予4、2、1 g/kg的AsⅣ灌胃，正常对照组、模型对照组每日予0.5%羧甲基纤维素钠20 mL/kg灌胃，各组均灌胃7 d。灌胃第8 d脱颈椎处死各组小鼠。

1.3.2 各组小鼠心肌组织病理形态观察 处死各组小鼠后留取心肌组织，沿左心室长轴切开，用10%甲醛固定后石蜡包埋切片，HE染色，观察各组心肌细胞、心肌组织病理学改变。

1.3.3 各组小鼠血清中LDH、CK-MB测定 将麻醉小鼠眼眶取血，静置30 min，用3 000 /min,10 min离心取血清。采用全自动生化分析仪对处理好的样本进行检测，检测指标为LDH、CK-MB，实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 加入AsⅣ的CVB3感染的心肌细胞OD值比较 空白对照组、病毒对照组细胞OD值分别为0.702 8±0.021 1、0.461 8±0.045 0，20、10、5、2.5、1.25 mg/L的AsⅣ组细胞OD值分别为0.621 0±0.097 8、0.618 9±0.089 0、0.612 3±0.098 7、0.603 4±0.879 3、0.576 4±0.108 9。与空白对照组比较，病毒对照组及AsⅣ组各亚组细胞OD值降低(P均<0.05)；与病毒对照组比较，及AsⅣ组各亚组细胞OD值升高(P均<0.05)。

2.2 加入AsⅣ的CVB3感染的心肌细胞细胞上清液LDH、CK-MB含量比较 空白对照组CVB3感染的心肌细胞LDH、CK-MB含量分别为(49.21±1.98)、(83.6±12.72)U/L，病毒对照组CVB3感染的心肌细胞LDH、CK-MB含量分别为(82.17±2.31)、(122.36±15.48)U/L，1.25、2.5、5、10、20 mg/L的AsⅣ组心肌细胞LDH含量分别为(78.24±1.56)、(73.56±2.32)、(72.21±3.21)、(67.83±2.14)、(64.56±3.12)U/L，CK-MB含量分别为(120.66±3.27)、(108.37±2.12)、(97.48±3.67)、(95.65±2.16)、(86.75±3.15)U/L。与正常对照组比较，病毒对照组心肌细胞LDH、CK-MB含量升高(P均<0.05)；与病毒对照组比较，10、20 mg/L的AsⅣ组心肌细胞LDH、CK-MB含量降低(P均<0.05)。

2.3 加入AsⅣ的VMC小鼠心肌组织病理形态 模型对照组及AsⅣ低、中剂量组分别死亡4、1、2只。与空白对照组比较，病毒对照组心肌组织排列紊乱，淋巴细胞和单核细胞出现介导的炎性浸润、心肌细胞出现明显出血水肿甚至坏死。AsⅣ组不同剂量心肌组织排列紊乱情况轻，淋巴细胞和单核细胞出现介导的炎性浸润、心肌细胞轻微出血水肿，心肌组织坏死以点状炎症和坏死灶为主。

2.4 加入AsⅣ的VMC小鼠血清LDH、CK-MB含量测定结果比较 见表1。与空白对照组比较，模型对照组心肌细胞LDH、CK-MB含量升高(P均<0.05)；与模型对照组比较，AsⅣ高、中、低剂量组心肌细胞LDH、CK-MB含量降低(P均<0.05)。

表1 各组乳鼠心肌细胞LDH、CK-MB含量

3 讨论

中药黄芪是来源于豆科黄芪属植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，史载于《神农本草经》中，具有显著的补气升阳、益卫固表、托毒生肌、利水消肿等功效，根据现代药理学研究表明，黄芪具有增强免疫、强心降压、降血糖、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤的功效，临床上可用于冠心病、心绞痛、病毒性心肌炎等疾病的治疗中。目前，黄芪己被列入我国卫生行政部门制定的有关病毒性心肌炎常规治疗方案中。本研究中所用的AsⅣ是从蒙古黄芪中分离纯化的主要活性成分，在药典中被作为黄芪质量检测标志物[17]。现代研究表明，AsⅣ具有抗炎[8]、抗氧化[9,10]、抗病毒[11]、增强免疫力[12]等药理作用。

原代乳鼠心肌细胞的体外培养，是将出生1～3天乳鼠心脏组织剪碎，用特定浓度的消化酶进行消化，使心肌组织变成单个的心肌细胞，在适宜的体外环境下，贴壁生长的一种细胞培养技术。原代乳鼠心肌细胞在感染CVB3病毒后3～5天就可以发生较明显的细胞病变，早期便可以直接损害心肌细胞。临床上一般采用检测心肌酶的表达水平来间接检测心肌细胞的损伤程度，LDH、CK-MB是诊断病毒性心肌炎的标志性心肌酶。在CVB3感染的心肌细胞模型中，由于心肌细胞受损，细胞膜通透性升高，胞内酶大量释放进入血液中，导致LDH、CK-MB的活性升高[18]。AsⅣ治疗组(20、10、5 mg/L)CPE明显减轻，细胞搏动有力。MTT染色结果显示，给药各浓度组与病毒对照组比较，给药组的细胞存活率明显增高，细胞搏动较好，形态正常，两组间平均OD值有显著性差异。故AsⅣ作用于CVB3感染的心肌细胞后，细胞病变明显减轻，上清液中的心肌酶的活性明显降低，差异有统计学意义，说明AsⅣ可以减轻CVB3感染所造成的心肌细胞损伤，能维持心肌细胞正常功能，对心肌细胞具有较好的保护作用。在CVB3感染的小鼠模型中，通过HE染色法可观察到感染病毒的小鼠的心肌组织形态，病毒对照组心肌组织排列紊乱，淋巴细胞和单核细胞出现介导的炎性浸润、心肌细胞出现明显出血水肿甚至坏死。AsⅣ给药组尚可观察到病灶出现，以点状炎症和坏死灶为主，病变程度相对于病毒对照组较轻，能明显减轻CVB3感染的心肌组织病变程度。

综上所述，加入AsⅣ可促进CVB3感染心肌细胞的存活，加入AsⅣ的VMC乳鼠心肌细胞炎症反应轻，AsⅣ对CVB3感染的心肌细胞和VMC乳鼠心肌细胞均具有明显的保护作用，AsⅣ可明显抑制CVB3感染，减轻了CVB3感染造成的心肌损伤，其机制可能为AsⅣ通过减少LDH和CK-MB的释放、抑制病毒增殖以及对心肌细胞及心肌组织的保护作用，但其具体治疗机制尚有待于进一步研究。