缺氧缺血性脑损伤大鼠小肠黏膜屏障功能变化观察

罗燕军，黄娟，许慧

(湖北省妇幼保健院，武汉430070)

围生期缺氧缺血性脑损伤(hypoxic -ischemic brain damage，HIBD)是导致围生期小儿死亡、神经系统后遗症的主要原因之一。HIBD相关脑性瘫痪(cerebral palsy，CP)的发病率可达0.2%～0.3%[1,2]。CP患儿除运动障碍和姿势异常外，多伴有喂养困难、营养不良、胃食管反流、慢性便秘或与反复腹泻交替等胃肠道问题[3]；若积极改善胃肠功能和营养状态，患儿粗大运动功能等可随之改善[4，5]。D-乳酸(D-LA)是大肠杆菌等肠道菌群的代谢产物，血浆D-LA水平可部分反映胃肠道通透性和肠黏膜屏障功能的改变。肠脂肪酸结合蛋白(iFABP)可参与对长链脂肪酸等的摄取和运输；正常情况下，周围血中无法检测到iFABP。绒毛高度、隐窝深度是衡量小肠消化吸收的重要指标。机械屏障是肠黏膜屏障的主要组成成分[6，7]，由完整的肠黏膜上皮细胞及黏膜上皮细胞间的紧密连接构成。紧密连接主要是由跨膜蛋白 Occludin、紧密连接蛋白 ZO-1等组成，仅容许离子和小分子可溶性物质通过，避免大分子物质与微生物通过。肠屏障功能损伤可导致肠道低程度炎症持续存在，肠内毒素、致病微生物、过敏原等易于通过受损肠黏膜进入体内。目前，紧密连接蛋白在CP患儿肠屏障功能障碍中的作用机制尚未见报道。2018年3～5月，我们观察了HIBD模型大鼠小肠黏膜屏障功能的变化，并探讨其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与仪器 7日龄SD大鼠共90只，体质量9～16 g。由武汉大学实验动物中心提供[生产许可证号为SCXK(鄂)2008-0004]。所有大鼠均分笼饲养于武汉大学实验动物中心，保持适宜环境温度为20～22 ℃；相对湿度为50%～70%，清洁安静。浓缩型正常山羊血清(封闭)(武汉博士德生物工程有限公司)；Occludin, ZO-1(一抗，美国 Invitrogen 公司)；荧光(Cy3)标记羊抗兔IgG(武汉博士德生物工程有限公司)；D-乳酸、肠脂肪酸结合蛋白ELISA 试剂盒(Biovision公司)。

1.2 SD大鼠分组及HIBD模型制备 取90只大鼠，按随机数字表法将大鼠随机分成正常组、假手术组和模型组，每组30只。模型组大鼠采用Rice等[8]方法制备HIBD模型：给予大鼠6%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉；颈正中切口，分离左侧颈总动脉后行双重结扎；从双重结扎线中间剪断颈总动脉；缝合颈正中切口；术后2～3 h，将模型大鼠置于39 ℃恒温密闭缺氧箱中，向缺氧箱中持续通入8% O2+92% N2的混合气体，气流量 1 L/min，维持2.5 h。假手术组大鼠予颈总动脉分离后并不结扎，直接缝合切口且不做缺氧处理。正常组大鼠不予手术、缺氧处理。实验期间不限制饮水量，以普通干饲料喂养。造模第1天取模型组大鼠3只，处死后分别取大脑皮层及海马、纹状体、丘脑组织，HE染色后，镜下观察大脑皮层及海马、纹状体、丘脑神经细胞损伤/梗死情况，进一步确定HIBD造模成功。所有实验操作都符合湖北省动物伦理管理委员会的操作规则。

1.3 各组大鼠眼球血清D-LA、iFABP检测 采用ELISA 法。分别于造模第1、7、21天取三组大鼠各10只，摘除眼球取血，以EDTA 抗凝，4 ℃，500 × g 离心 5 min，取血清，ELISA 法[11]检测各组大鼠眼球血清D-LA、iFABP，所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。重复3次，取平均值。

1.4 各组大鼠小肠黏膜小肠绒毛高度和隐窝深度观察 取血后处死大鼠，取回肠末端肠段，10%中性甲醛溶液固定，脱水、透明，包埋，切片，H-E染色后显微镜下观察并记录小肠绒毛高度和隐窝深度。重复3次，取平均值。

1.5 各组大鼠回肠末端紧密连接蛋白Occludin、ZO-1检测 采用免疫荧光染色[12]法。取大鼠回肠末端肠段8～10 cm，按免疫荧光染色试剂盒说明书进行操作。在激光共聚焦显微镜下(× 400倍)观察并采集图像，测定积分光密度值(integrated optical density, IOD值),以IOD值代表Occludin、ZO-1的相对表达量。重复3次，取平均值。

2 结果

实验期间，正常组和假手术组大鼠均毛色白润，食欲好，反应灵敏，体质量增加良好，大小便正常，未出现死亡。HIBD组存活大鼠皮毛松弛，毛色无光泽，精神萎靡，反应迟钝，活动量少，进食量较少，腹泻和便秘多交替出现，体质量增长速度较缓慢。

造模第1天，采用斜坡实验、悬吊实验[9，10]评价三组大鼠神经行为各组大鼠神经行为观察，与正常组、空白组比较，HIBD 组大鼠斜坡实验时间短、悬吊实验评分高(P均<0.05，表明HIBD大鼠的肌力和协调能力明显下降，提示HIBD造模成功。

2.1 三组大鼠眼球血清D-LA、iFABP水平比较 造模第1、7、21天三组大鼠眼球血清D-LA、iFABP水平比较见表1。 与正常组、假手术组比较，造模第1、7、21天HIBD 组眼球血清D-LA、iFABP水平均升高(P均<0.05).HIBD组造模各时点眼球血清D-LA、iFABP水平间差异均无统计学意义(P均>0.05)。

表1 造模第1、7、21天三组大鼠眼球血清D-LA、iFABP水平比较

注：与正常组、假手术组比较，aP<0.05。

2.2 三组大鼠小肠黏膜小肠绒毛高度和隐窝深度比较 各时间点处死大鼠，正常组和假手术组大鼠肠管呈粉红色，蠕动正常，无黏连、水肿及扩张；HIBD组大鼠肠管多呈鲜红色，蠕动慢，部分肠段明显扩张，肠黏膜组织质地脆，浆膜充血、水肿，部分大鼠腹腔内有少量腹水。

HE染色光镜下观察，正常组和假手术组大鼠小肠细胞形态正常，绒毛结构完整、排列整齐；HIBD组大鼠肠组织有不同程度损伤表现，部分绒毛脱落、变粗，甚至倒伏、断裂,间质和固有层水肿，绒毛顶端上皮细胞变性坏死。三组大鼠小肠绒毛高度和隐窝深度比较见表2。

表2 造模第1、7、21天三组大鼠小肠绒毛高度和隐窝深度比较

注：与正常组、假手术组比较，aP<0.05。

2.3 三组大鼠回肠末端Occludin、ZO-1的IOD值比较 造模第1、7、21天各组肠黏膜组织切片免疫荧光均可见Occludin、ZO-1阳性细胞(荧光呈红色)，位于肠绒毛表面。正常组和假手术组大鼠小肠绒毛表面Occludin、ZO-1线性分布，连续表达。HIBD组大鼠肠绒毛表面Occludin、ZO-1线性荧光结构紊乱、断裂，强度减弱，结构模糊。造模第1、7、21天三组大鼠回肠末端Occludin、ZO-1的IOD值比较见表3。与正常组、假手术组比较，造模第1、7、21天HIBD 组大鼠回肠末端Occludin、ZO-1的IOD值均降低(P均<0.05).HIBD组造模各时点大鼠回肠末端Occludin、ZO-1的IOD值间差异均无统计学意义(P均>0.05)。

表3 造模第1、7、21天三组大鼠回肠末端Occludin、ZO-1的IOD值比较

注：与正常组、假手术组比较，aP<0.05。

3 讨论

我国围生期儿童CP的发病率达2‰～5‰，这类患儿常出现喂养困难、呕吐、腹胀、消化不良等消化道不良反应，并可进一步导致营养不良、吸入性肺炎、脓毒血症和多脏器功能衰竭等并发症[13]。因此，探讨CP消化系统功能变化及其机制，以采取相应措施改善患儿消化系统功能和营养不良，对提高CP预后具有积极的意义。HIBD模型是研究CP的常用模型，该方法造模成功率高，操作简单，死亡率较低。尼氏染色见模型大鼠大脑皮层及海马、纹状体、丘脑神经细胞出现损伤/梗死的病理改变，同时术后神经行为学检查显示，模型组大鼠存在明显异常，提示造模成功。悬吊试验和斜坡试验均是HIBD模型大鼠常用的神经行为学测试方法[9，10]。悬吊试验反映大鼠的肌肉力量，斜坡试验则反映大鼠身体的协调能力。本研究发现，模型组大鼠神经行为学评分未随术后时间的推移而明显改善，说明本模型神经系统损伤持续存在，模型稳定。模型大鼠食欲差、体质量增长缓慢；模型大鼠小肠黏膜、浆膜等存在充血水肿、肠蠕动减少等改变，提示存在胃肠道功能障碍。

肠组织HE染色可见HIBD大鼠小肠黏膜绒毛上皮细胞变性坏死，肠绒毛高度、隐窝深度均明显降低。正常的小肠绒毛结构是营养物质消化与吸收的前提，作为小肠绒毛的基本结构，绒毛高度、隐窝深度是衡量小肠消化吸收的重要指标[14]。隐窝底部的干细胞不断分化，以补充黏膜上皮的正常脱落；而隐窝深度体现肠黏膜上皮细胞的新生能力，隐窝变浅提示肠黏膜上皮细胞成熟率上升，肠黏膜更新缓慢。本组模型大鼠肠绒毛萎缩、隐窝变浅，且未随术后时间延长而有所改善，提示HIBD大鼠持续存在消化吸收功能降低，肠绒毛更新缓慢。这些变化有助于解释CP儿童常存在营养不良。

D-LA是肠道固有菌群如大肠杆菌、乳杆菌等的代谢产物，人类正常组织并不生成D-LA，而缺乏D-LA脱氢酶，无法将其快速代谢，血浆D-LA水平可部分反映胃肠道通透性和肠黏膜屏障功能的改变[7]。iFABP仅存于哺乳动物的胃肠道，主要位于小肠黏膜上皮细胞胞质中，具有较好的器官特异性，参与小肠对长链脂肪酸等的摄取和运输；正常情况下，周围血中无法检测到iFABP[11]。但当肠黏膜通透性增加时，iFABP释放，进入血液循环，周围血中可检测出iFABP。因此，血浆iFABP水平可以反应肠黏膜上皮细胞破坏的程度，且升高时间早于D-LA，不受进食状态、肠道菌群过度繁殖等的影响，可作为肠黏膜损害早期诊断特异而敏感的血清标志物。模型组大鼠血清D-乳酸、iFABP水平明显升高，提示HIBD大鼠存在小肠屏障功能异常。模型组大鼠血清D-乳酸、iFABP水平未随术后时间延长而降低，提示HIBD大鼠小肠屏障功能障碍难以自行逆转，需要进行积极临床干预。

肠黏膜上皮细胞、细胞间紧密连接和细胞骨架蛋白等构成了肠道机械屏障，上皮细胞间紧密连接主要是由跨膜蛋白 Occludin、紧密连接蛋白 ZO-1等组成的复合体构成，并位于紧密连接的顶端。细胞间紧密连接结构破坏可引起细胞间隙扩大，最终引起肠黏膜屏障功能障碍[15]。本研究中正常组和假手术组大鼠小肠黏膜表面Occludin、ZO-1呈连续线性表达；HIBD模型组大鼠小肠黏膜表面Occludin、ZO-1线性结构紊乱，Occludin、ZO-1表达量减少，且与大鼠血清D-乳酸、iFABP水平以及小肠绒毛高度、隐窝深度研究结果一致，表明HIBD后小肠屏障功能障碍的发生与小肠黏膜结构破坏及更新缓慢相关，且小肠黏膜屏障功能损伤后难以自行修复。

综上所述，HIBD大鼠眼球血清D-LA、iFABP水平升高，回肠末端肠绒毛高度和隐窝深度降低，HIBD大鼠存在小肠屏障功能障碍，伴随小肠黏膜绒毛、隐窝结构破坏，Occludin、ZO-1蛋白表达减少，且难以自行逆转。改善小肠黏膜屏障功能可能有助于改善CP患儿营养不良，促进患儿康复。