子宫腺肌病小鼠子宫内膜基底/功能层上皮细胞、间质细胞、平滑肌细胞中ROCK1蛋白表达观察

陶娅玲，朱亮亮，邹嘉乐，杜威，付先芸

(1三峡大学人民医院，湖北宜昌443000；2三峡大学医学院)

子宫腺肌病(adenomyosis AM)是指子宫内膜向肌层良性浸润并在其中弥漫性生长。AM的主要病理特征是在子宫肌层中出现了异位的内膜和腺体，伴有其周围的肌层细胞肥大和增生。年龄>40岁的女性AM发病率高达24.4%[1]。AM患者常常伴随有月经过多(50%)、痛经(30%)和子宫出血(20%)[2]，严重影响女性的生活质量。AM是一种良性疾病，但它与癌症有一些共同特点，如侵袭性和转移性。肿瘤细胞的迁移、侵袭均需要细胞骨架的重新排列。ras同源基因家族(Rho)蛋白属于小G蛋白超家族的亚家族成员，到目前为止已发现20多个Rho家族成员，在细胞骨架重组调控方面起重要作用。进一步研究[3]发现，Rho/与Rho相关的蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶(ROCK1)通路参与调控肿瘤细胞骨架的重组。但目前关于Rho/ROCK1信号通路在子宫内膜异位症及AM发生中的具体作用机制相关研究较少。2018年7～10月，我们观察了AM小鼠子宫组织及子宫内膜基底层(NJ)/内膜功能层(NG)上皮细胞、间质细胞、平滑肌细胞中ROCK1的表达变化，探讨其与内膜侵袭能力的相关性。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 将出生日设为第1 天，出生2 d的雌性ICR小鼠38只，清洁级，饲养温度18 ℃～24 ℃，明暗周期12 h，出生21日由母鼠哺乳饲养，22 日龄起与母鼠分笼，自由摄食饮水。ICR小鼠购买自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号SCXK(京)2016-00061.2。Rho试剂、ROCK1试剂均购于英国Abcam公司(ab40673，ab45171)；GAPDH试剂购于中国武汉Servicebio公司(GB12002)。SDS-PAGE电泳仪(厂家Bio-Red，型号Bestell-Nr 40-800),恒温摇床(厂家LAB，型号LAB-LINE),冷冻高速离心机(厂家Sigma，型号Sigma 1-15K)。

1.2 动物分组及AM造模方法 取38只小鼠，通过随机区组设计产生随机序列分为空白组8只，模型组30只。模型组采用初生小鼠枸橼酸他莫昔芬灌胃法制作AM模型：取第2 天小鼠 滴喂5 μL/g 花生油/卵磷脂/炼乳混合液(体积比为2∶0.2∶3)+2.7 μmol /kg 枸橼酸他莫昔芬，1次/d,连续滴喂3 d。空白组小鼠不做任何处理，正常饲养。母鼠哺育小鼠期间模型组死亡3只，饲养过程中模型组死亡1只。最后纳入统计模型组26只，空白组8只。

1.3 小鼠子宫组织内膜浸润程度观察 饲养两组小鼠至12周龄，引颈处死后取子宫组织，石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察两组小鼠子宫组织内膜浸润程度。根据浸润情况分为4度。0度：无明显浸润；1度：轻度浸润，间质或上皮细胞浸润至NJ界面下，未超过浅肌层内1/2；2度：中度浸润，间质及上皮细胞浸润至浅肌层外1/2；3度：重度浸润，间质及上皮细胞浸润至深肌层或浆膜下。

1.4 小鼠子宫组织Rho、ROCK1蛋白检测 采用Western blotting法。取两组子宫组织，提取子宫总蛋白，总蛋白定量，PVDF 膜蒸馏水漂洗并封闭加入一抗，洗膜，加入二抗，洗膜，室温孵育，所有操作均严格按照试剂盒说明书进行，以目的条带的灰度值代表Rho、ROCK1蛋白的相对表达量，实验重复3次，取平均值。

1.5 小鼠子宫NJ平滑肌细胞、NJ上皮细胞、NJ间质细胞、NG上皮细胞、NG间质细胞ROCK1蛋白检测 采用免疫组化法检测两组小鼠子宫NJ平滑肌细胞、NJ上皮细胞、NJ间质细胞、NG上皮细胞、NG间质细胞ROCK1蛋白。取两组子宫组织，石蜡切片脱蜡处理，3%H2O2室温孵育，蒸馏水冲洗，PBS 浸泡，封闭，加一抗 孵育，PBS冲洗，滴加二抗，孵育，PBS 冲洗，滴加适量的辣根酶工作液，孵育，显色，PBS冲洗，自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。利用 BI-2000系统，在光镜下( 10×20倍)选取相同部位相同视野照相分析，计算每个视野阳性染色的平均光密度OD值。重复3 次，取平均值。

2 结果

2.1 两组小鼠子宫组织内膜浸润程度比较 空白组子宫组织无内膜浸润，模型组AM病灶轻度、中度、重度浸润分别为8、12、6例。

2.2 两组小鼠子宫组织Rho、ROCK1蛋白相对表达量比较 模型组、空白组子宫组织Rho相对表达量分别为0.442±0.094、0.109±0.073，二者比较，P<0.01；模型组、空白组子宫组织ROCK1相对表达量分别为1.554±0.079、0.079±0.006，二者比较，P<0.01。

2.3 两组小鼠子宫NJ平滑肌细胞、NJ上皮细胞、NJ间质细胞、NG上皮细胞、NG间质细胞ROCK1蛋白表达比较 结果见表1。

表1 两组小鼠子宫NJ平滑肌细胞、NJ上皮细胞、NJ间质细胞、NG上皮细胞、NG间质细胞ROCK1蛋白OD值比较

注：与空白组比较，＊P<0.05；与模型组NJ上皮细胞、NJ间质细胞比较，#P<0.05；与模型组NJ上皮细胞比较，&P<0.05。

2.4 不同浸润深度的AM小鼠NJ平滑肌细胞、NJ上皮细胞、NJ间质细胞、NG上皮细胞、NG间质细胞ROCK1蛋白OD值比较 结果见表2。

2.5 AM小鼠子宫NJ上皮细胞、NJ间质细胞、NG上皮细胞、NG间质细胞ROCK1蛋白表达相关性 AM小鼠子宫NJ上皮细胞、NG上皮细胞ROCK1蛋白表达呈正相关(r=0.913,P<0.05);AM小鼠子宫NJ上皮细胞、NJ间质细胞ROCK1蛋白表达呈正相关(r=0.893,P<0.05);AM小鼠子宫NG上皮细胞、NG间质细胞ROCK1蛋白表达呈正相关(r=0.866,P<0.05);AM小鼠子宫NG间质细胞、NJ间质细胞ROCK1蛋白表达呈正相关(r=0.897,P<0.05)。

表2 不同浸润深度的AM小鼠NJ平滑肌细胞、NJ上皮细胞、NJ间质细胞、NG上皮细胞、NG间质细胞ROCK1蛋白OD值比较

注：与无浸润比较，＊P<0.05；与重度浸润比较，#P<0.05。

3 讨论

目前常规内分泌治疗及手术治疗AM不良反应较大，尤其不适合有生育要求的女性。AM具有侵袭性、转移性等特点。现有研究已证实，肿瘤细胞的迁移和侵袭需要细胞骨架的重新排列。参与细胞骨架结构形成的肌动蛋白丝、微管和中间丝，如应力纤维和假足，可促进肿瘤细胞的侵袭和转移能力的提高。Rho和ROCK1信号通路参与了细胞骨架的调控[4]。ROCK1可提升细胞骨架中肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)的磷酸化水平，增加肌动-肌球蛋白的收缩力，为细胞迁移提供持续运动的动力，促使细胞的迁移能力提高。ROCK1通路参与了从静态到迁移细胞行为的转变，ROCK1信号调控细胞骨架影响肿瘤迁移细胞骨架的机制已在卵巢癌[3]、乳腺癌[5]、胰腺癌[6]、肺腺癌细胞[7]等肿瘤细胞中得以证实。本实验结果显示，AM小鼠子宫组织Rho与ROCK1的表达水平升高，与现有的研究结果一致[8]。进一步研究表明，不同部位的ROCK1表达在轻度浸润组、中度浸润组及重度浸润组间存在显著差异。研究[9]亦证实，ROCK1在中重度痛经AM患者中显著升高，该结果表明ROCK1的高表达可通过调节细胞骨架、增强细胞迁移能力从而显著增强AM的浸润能力，导致相关临床症状发生。

子宫内膜异位症、AM起源于基底层的子宫内膜，大部分研究关注基底层子宫内膜的特性，子宫腺肌病患者功能层和基底层子宫内膜在激素表达及其受体表达方面确证存在明显的生物学差异[10]。但现有研究[11]也逐渐认识到，AM的侵袭性并不是由单一的基底层细胞迁移机制驱动的，而是由组织损伤和修复机制的介入及细胞化生造成的上皮-间质转变(epithelial-mesenchy mal transition, EMT)两个过程的时间依赖组合驱动。同时，本实验表明，不同组别ROCK1的表达变化并不局限在基底层，基底层内膜及功能层内膜并无无显著差异，该结果证实，内膜侵袭能力的形成不仅发生在基底层，功能层内膜的功能异常也参与其中，考虑远离基底层的功能层子宫内膜会出现周期性的内膜剥脱与修复过程。因此，ROCK1上调的发生机制部分可能与内膜功能层组织持续损伤与修复机制的异常有关。

EMT是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间质细胞转分化的现象。在EMT过程中,上皮细胞失去细胞极性,丧失细胞间紧密连接和粘附连接,获得了浸润性和游走迁移能力,变成了具有间质细胞功能和特性的细胞。EMT在肿瘤中赋予细胞迁移、浸润的能力。而AM的内膜细胞的侵入过程与这一过程非常相似,EMT现在已经被证实通过促进侵袭和纤维发生参与了子宫内膜异位症的发展[12]。人结直肠癌HCT116细胞中，Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子以一种依赖EMT状态的方式上调，并通过激活Rho/ROCK1通路促进细胞迁移[13]。本实验结果表明无论在NJ层或内膜功能层，ROCK1的表达上皮细胞显著高于间质细胞，间质细胞与上皮细胞表达具有显著相关性。该结果证实，上皮及间质细胞在调节细胞骨架重排列、从而导致内膜侵袭能力的异常增强中有相似的作用，推测与AM发生机制中存在EMT[14]、上皮细胞与间质细胞具有部分同源性有关。

综上所述，AM小鼠子宫组织Rho、ROCK1高表达，子宫NJ、NG不同细胞ROCK1蛋白均呈高表达。子宫不同部位上皮细胞ROCK1蛋白的表达与间质表达呈正相关，ROCK1蛋白高表达与AM的侵袭能力相关。Rho/ROCK1通路与AM侵袭能力相关，AM的发生机制并不仅仅局限于内膜基底层，同时与内膜功能层的损伤与修复机制的异常介入有关。AM发生时，上皮细胞、间质细胞及平滑肌细胞内ROCK1的表达同步上调，可能与因EMT而产生的细胞同源性有关，尚待进一步的研究。