丹参酚酸B灌胃的免疫性自然流产模型小鼠流产情况、胎盘和脾脏组织淋巴细胞及炎症因子表达观察

王晶，董光苹，周娟，于琴，严骅

(上海中医药大学附属曙光医院，上海201203)

胚胎反复移植失败(RIF)是指年龄≤40岁的女性，在三个治疗周期中移植至少4个优质胚胎仍未能实现临床妊娠。RIF的病因繁杂，治疗周期长，是目前生殖领域的一大热点问题[1]。胎盘在维持母胎免疫耐受等多种方面起到关键作用。胎盘对妊娠早期促炎症信号传导非常敏感，促炎症因子的过度刺激或者感染等因素均可导致流产[2]。CBA/J (H-2k) (H-2k)雌性小鼠与DBA/2(H-2d) 雄性小鼠交配后制备的免疫性自然流产模型，是常用的以母胎免疫因素引起流产的动物模型[3]。胎盘组织中淋巴细胞的免疫耐受状态可能与RIF有关。流产胎盘中的坏死细胞可促进TNF-α分泌。Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)与妊娠疾病关联紧密，可导致有害妊娠结局[3]。丹参水溶性提取物丹参酚酸B(Sal B)是具有免疫、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、改善内皮功能障碍、改善免疫失衡等作用[4]。针对Sal B对胚胎发育毒性实验[5]发现，100 mg/kg的丹酚酸B对胚胎发育无毒性，也未见明显遗传毒性。Sal B在多种疾病模型都有很好的治疗效果，但目前在自然流产中的治疗作用相关研究较少。我们观察了Sal B灌胃免疫性自然流产模型的流产情况、胎盘和脾脏组织淋巴细胞及胎盘组织炎症因子表达情况，探讨Sal B是否通过抑制炎症反应及诱导免疫耐受作用来改善妊娠结局。

1 材料与方法

1.1 动物、药物 8～12周CBA/J (H-2k)(H-2k)雌性小鼠60只、CBA/J (H-2k)(H-2k)雄性小鼠30只，DBA/2(H-2d)雄性小鼠(Shizuoka, Japan)5只，体质量18g～22 g。Sal B购买于上海Nature Standard公司。

1.2 免疫性自然流产小鼠模型制备及Sal B给药方法 每日下午4～6点观察CBA/J (H-2k)雌鼠发情情况，取动情期CBA/J (H-2k)雌鼠与CBA/J (H-2k)雄鼠交配，第二天早8点观察雌鼠阴栓，有阴栓者为妊娠第0.5天，最终获得妊娠CBA/J (H-2k)雌鼠10只为CBA/J (H-2k)×CBA/J (H-2k)正常免疫耐受妊娠组(正常妊娠组)；每日下午4～6点观察CBA/J (H-2k)雌鼠发情情况，取动情期雌鼠CBA/J (H-2k)与DBA/2(H-2d)雄鼠交配,第二天早8点观察雌鼠阴栓，有阴栓者为妊娠第0.5天，制作免疫性自然流产小鼠模型，最终获得免疫性自然流产模型小鼠妊娠鼠52只，将免疫性自然流产模型小鼠妊娠鼠随机分为模型组、治疗组各26只。从妊娠0.5天开始，正常妊娠组、模型组每日早9点蒸馏水0.5 mL灌胃，1 d/次至妊娠第12.5天；治疗组于妊娠0.5天每日早9点Sal B 100 mg/kg灌胃，1 d/次至妊娠第12.5天。

1.3 三组雌鼠流产情况观察 妊娠第12.5天观察三组雌鼠流产情况：流产率= [流产胚胎数/(流产胚胎数+ 存活胚胎数)]×100%。妊娠第12.5天取三组雌鼠处死后，保存子宫、蜕膜、胎盘及脾脏组织，-80 ℃保存备用。

1.4 三组脾脏组织T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞检测 采用流式细胞术。取雌鼠脾脏组织，流式细胞仪测算三组脾脏组织T细胞(CD45+CD3+CD4+CD8+)，B细胞(CD45+B220+)和巨噬细胞(CD45+CD11b+)，NK细胞(CD45+CD49b+)。用FACS(BD-Biosciences)流式细胞仪测算阳性细胞比例。重复3次，取平均值。

1.5 三组胎盘组织CD3+T细胞、NK细胞、巨噬细胞、B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞检测 取雌鼠胎盘组织，流式细胞仪测算CD3+T细胞(CD45+CD3+)，NK细胞(CD45+Nkp46+)，巨噬细胞(CD45+CD11b+)，B细胞(CD45+B220+)，CD4+T细胞(CD45+CD4+)CD8+T细胞(CD45+CD8+)阳性比例。所有操作同“1.4”，重复3次，取平均值。

1.6 三组胎盘组织NF-κ B 、TNF -α、TLR-2、TLR-4、TLR-7 mRNA检测 采用RT-PCR法。取三组胎盘组织20 mg，切碎后匀浆提取cDNA。cDNA合成反应使用TAKARA(37 ℃ 15 min , 85 ℃ 5 s , 4 ℃)合成。RT-PCR反应95 ℃ 30 s , 95 ℃ 5 s , 60 ℃ 30 s, 25 ℃ 2 min。以2-ΔΔCt代表NF-κB 、TNF-α、TLR-2、TLR-4、TLR-7 mRNA相对表达量。重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 三组流产率比较 治疗组共获得正常胚胎192个，流产胚胎11个，流产率6.00%±11.16%，模型组共获得正常胚胎168个，流产胚胎44个，流产率21.00%±13.37% ,正常妊娠组共获得正常胚胎94个，流产胚胎13个，流产率 14.00%±9.43%。与正常妊娠组比较，模型组流产率升高(P<0.05)，与模型组比较，治疗组流产率降低(P<0.05)。

2.2 三组脾脏组织中T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞比例比较 见表1。由表1可见，三组脾脏组织T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞比例比较，P均>0.05。

表1 三组脾脏组织CD3+T细胞、NK细胞、巨噬细胞、B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞表达比例

2.3 三组胎盘组织CD3+T细胞、NK细胞、巨噬细胞、B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞比例比较 结果见表2。

表2 三组脾脏组织CD3+T细胞、NK细胞、巨噬细胞、B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞表达比例比较

注：与模型组相比较,*P<0.05。

2.4 三组胎盘组织NF-κB 、TNF -α、TLR-2、TLR-4、TLR-7 mRNA相对表达量比较 结果见表3。

表3 各组胎盘组织NF-κB 、TNF -α、TLR-2、TLR-4、TLR-7相对表达量比较

注：与模型组比较，*P<0.05；与正常妊娠组比较，&P<0.05。

3 讨论

妊娠是一种半同种异体移植的过程。目前认为涉及妊娠维持的耐受机制与长期移植物接受相似，打破胎儿-母体界面的天然耐受环境可能会引起母体免疫系统对胎儿的排斥，即出现免疫性自然流产[6,7]。流产胎盘中的坏死细胞可促进TNF-α分泌，胚胎发育环境中TNF-α的升高是引起流产的病因之一，同时流产也会刺激子宫及胎盘中淋巴细胞分泌更多的TNF-α[8]。在病原体识别作用中TLR发挥重要作用，TLR受体与妊娠疾病关联紧密，例如炎症、感染等多种因素作用于TLR-4时，先天免疫系统会被直接激活，TLR-4的激活导致相关的各细胞释放过多的促炎症因子，诱导滋养细胞凋亡，从而产生有害的妊娠结局[9]。正常的妊娠是促炎症和抗炎症相互交替相互平衡的过程，因此在母胎界面中Th1及NK细胞等分泌适当的促炎症因子有助于胚胎着床及血管重塑等，但分泌过多的促炎症因子会引起滋养细胞的凋亡从而导致流产[10]。

丹参是唇形科鼠尾草属多年生草本植物，丹参的干燥根及根茎用药始载于《神农本草经》[11]。丹参的水溶性成分以丹参酚酸为主，其中Sal B的含量最高，约占70%，且作用活性最强[12]。有研究[13]表明，Sal B可以在老鼠模型中通过抑制炎症反应，如 TNF-α 和iNOS的降低来激活HO-1，同时可以改善内皮功能障碍，上调抗炎反应，用已知上调HO-1表达的Sal B处理，显示出对长期移植物的免疫耐受作用。因此，我们认为Sal B可能对自然流产小鼠模型具有一定的免疫调节作用。

CBA/J (H-2k) (H-2k)雌性小鼠与DBA/2(H-2d) 雄性小鼠交配是与妊娠疾病包括复发性流产、先兆子痫等相关的动物模型。相比较于CBA/J (H-2k) (H-2k)×CBA/J (H-2k) (H-2k)同种免疫耐受模型组，自然流产模型小鼠交配后会出现较高的流产率。本实验CBA/J (H-2k) × CBA/J (H-2k) 同种免疫耐受小鼠作为正常妊娠模型组，其流产率为14%。本实验CBA/J (H-2k)×DBA/2(H-2d)自然流产小鼠模型流产率在21%,Avishai等[14]检测了复发性流产患者中的外周血和胎盘组织标本中NKp46及Nkp30的表达，发现该患者相比较于正常妊娠对照组，Nkp46表达显著升高且有统计学意义。这可能与激活的NK细胞中NKp46表达升高，通过释放穿孔素及TNF-α、IFN-γ等细胞因子导致滋养层细胞凋亡有关，最终引起流产结局。实验中发现在12.5天的胎盘组织中淋巴细胞表达的NKp6与Sal B治疗组中的胎盘表达相比较，自然流产模型组表达显著升高。在治疗组中，胎盘中表达的细胞毒性T细胞CD8+表达相比较于自然流产模型组显著降低。因此Sal B在自然流产小鼠模型中具有一定的免疫调节作用。此外Sal B可通过降低TNF-α、IFN-γ等细胞因子来改善母胎免疫耐受微环境。本实验显示 TLR-2、TLR-4、TLR-7的基因表达在治疗组和正常妊娠组中显著降低，因此Sal B 可显著抑制胎盘中滋养细胞表达的TLR-2、TLR-4、TLR-7 mRNA的表达，同时可以抑制NF-κB、TNF-α的mRNA表达，Sal B可能通过抑制TLR-4-NF-κB-TNF-α炎症反应通路有关，Sal B 通过该通路来抑制滋养细胞的凋亡，降低流产率。

综上所述，Sal B灌胃的免疫性自然流产模型小鼠胎盘组织Nk细胞、CD8+T细胞比例降低，NF-κB、TNF -α、TLR-2、TLR-4、TLR-7 mRNA相对表达量均降低。Sal B可能通过抑制胎盘组织TLR-4-NF-κB-TNF-α炎症反应通路，发挥免疫调节作用。