原肌球蛋白相关激酶B受体及其信号通路在低频重复经颅磁刺激治疗癫痫大鼠中的作用

付翁 杨锦 齐琦 王明阳 谢伟

包头医学院生物医学研究中心与神经科学研究所（内蒙古包头014040）

急性脑卒中、脑肿瘤或脑外伤是癫痫患者的常见病因，而药物治疗可能发展为药物难治性癫痫，手术治疗风险和创伤大、成本高［1］。重复经颅磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS）可有效治疗某些神经系统疾病［2-5］。rTMS 常分为低频（≤1 Hz）和高频（≥5 Hz）两类，高频rTMS 可导致大脑皮层长时程增强作用，用于治疗抑郁症；相反，低频rTMS 导致长时程抑制作用，是安全、有效治疗癫痫的方式［6］。但其分子机制尚未完全明确，因此了解相关机制有助于加深对癫痫发生及rTMS 效应的认识，避免潜在的风险。

脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）及其特异性原肌球蛋白相关激酶B 受体（tropomyosin-related kinase B receptor，TrkB）与癫痫的发生和发展密切相关［7］。研究［8］表明，TrkB 受体在癫痫状态下表达发生变化，随之引起BDNF/TrkB 信号通路的抑制。而低频rTMS 可激活BDNF/TrkB 信号通路并调节神经元突触可塑性［9］，但低频rTMS 能否通过调控TrkB 受体和信号通路发挥其抗癫痫作用仍有待研究。因此本研究利用大鼠癫痫模型，使用低频rTMS（1 Hz）对模型进行干预，之后检测TrkB 受体、BDNF/TrkB 信号通路和痫样放电的变化情况，从TrkB 受体和信号通路角度，揭示低频rTMS 治疗癫痫的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物和主要试剂 健康成年雄性SD 大鼠，体质量200～250 g，购自内蒙古大学实验动物中心。兔源TrkB 单克隆抗体，购自美国Santa Cruz 公司；兔源磷酸化TrkB 单克隆抗体，购自美国CST 公司；鼠源β-actin 单克隆抗体，购自美国Santa Cruz公司；有芯玻璃电极，购自美国Sutter 公司；人工脑脊液、电极内液所需药品均购自美国Sigma 公司。

1.1.2 主要设备 经颅磁刺激仪（OSF），购自武汉奥赛福医疗科技有限公司；蛋白电泳转膜系统，美国Bio-Rad 公司产品；全自动化学发光成像分析系统（5800），中国Tanon 公司产品；振动切片机（Vibrating Microtome 5100mz），英国Campden 公司产品；电极拉制仪（P-97），美国Sutter 公司产品；膜片钳放大器（Axopatch 200B amplifier），美国Molecular Devices 公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 匹罗卡品诱导构建癫痫大鼠模型 大鼠腹腔注射氯化锂127 mg/kg。待24 h 后给予匹罗卡品20 mg/kg，给药后观察大鼠行为。若无癫痫发作或发作程度不够时，每30 min 重复注射匹罗卡品10 mg/kg，但最大剂量为60 mg/kg。大鼠从第1 次大发作开始，持续1 h 视为模型制作成功，之后腹腔注射水合氯醛3 mL/kg 终止发作。未进行任何处理的大鼠作为对照组。

1.2.2 低频rTMS 干预癫痫大鼠模型 将大鼠固定在合适的大鼠限制器中，使用直径为6 cm 的圆形线圈紧贴大鼠的头皮并与颅骨平行，采用OSF经颅磁刺激仪进行rTMS 干预。刺激频率为1 Hz，刺激强度为100%诱发麻醉大鼠后肢腓肠肌动作电位强度，为0.4 Tesla。连续进行14 d rTMS 干预，刺激参数为20 个脉冲宽度、70 μs 的单脉冲刺激为一串，共计20 串，每串间隔10 s。对照组和癫痫组大鼠固定在限制器中，线圈紧贴大鼠头皮但未进行磁刺激作为假干预组。

1.2.3 Western Blot 检测海马组织TrkB 受体蛋白的表达 各组大鼠麻醉后断头取脑并分离海马组织，使用加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂RIPA裂解液提取总蛋白，利用BCA 法测定蛋白浓度后，在12%的SDS-PAGE 中进行电泳并将蛋白转移至PVDF 膜上，室温封闭后加入一抗于4 ℃孵育过夜（兔抗大鼠TrkB 一抗1∶200 稀释，兔抗大鼠磷酸化TrkB 一抗1∶1 000 稀释，小鼠抗大鼠β-actin 一抗1∶1 000 稀释），之后分别使用1∶5 000 稀释的山羊抗兔、小鼠二抗于37 ℃孵育1 h。最终利用ECL 显影液进行发光并检测灰度值。

1.2.4 大鼠海马脑片急性分离 大鼠麻醉后断头，弯镊剥开颅骨并迅速取出大脑置于0～4 ℃的95%O2+5%CO2预先饱和的［人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF），120 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L KCl，1.25 mmol/L NaH2PO4，2 mmol/L MgSO4，2 mmol/L CaCl2，26 mmol/L NaHCO3，10 mmol/L 葡萄糖，pH=7.4）］中冰冻，取出后进行修块，置于切片槽中并使用振动切片机以海马长轴垂直方向，将脑组织切成300 μm 厚的脑片，立即将脑片置于95%O2+5%CO2预先饱和的ACSF中孵育1 h，维持温度在26 ℃。

1.2.5 膜片钳检测大鼠海马神经元放电 室温孵育1 h 后将海马脑片转移至记录槽中，使用配有红外CCD 的正置显微镜在40 倍水镜下寻找海马CA1区锥体神经元。实验前拉制有芯玻璃电极，电极尖端电阻为3～5 MΩ并充入电极内液（130 mmol/L KCl，10 mmol/L EGTA，2 mmol/L MgCl2，10 mmol/L HEPES，1 mmol/L CaCl2，4 mmol/L MgATP，pH=7.3）。电极入液后，使其尖端与神经元细胞膜形成高阻封接。施加负压破膜后补偿电容电流和串联电阻，在电流钳状态下调至I=0 模式，采用pCLAMP 10.0 软件来设定刺激方案、采集并储存神经元的放电活动，采用Clampfit 9.2 进行数据分析、制图和统计放电频率。

1.3 统计学方法 Western Blot 和膜片钳数据结果以x ± s表示，多组之间的比较采用单因素方差分析，两组之间比较采用t检验，应用SPSS 17.0软件进行统计分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 匹罗卡品诱导构建癫痫大鼠模型的鉴定 使用全细胞膜片钳分别记录对照组（Control）和癫痫组（Status Epilepticus）神经元的自发放电活动。对照组神经元放电偶然发生，频率为（0.45±0.01）Hz（图1A）。而癫痫组神经元呈现高频率、爆发式的放电（图1B），与对照组相比其放电频率（1.88 ±0.10）Hz显著升高（P＜0.05，图1D）。并且癫痫组神经元放电的inter-event interval 累计分布曲线明显左移（图1C），以上结果提示经匹罗卡品诱导成功构建癫痫大鼠模型。

图1 膜片钳记录神经元放电Fig.1 The discharges of neurons recorded by patch clamp

2.2 TrkB 受体蛋白在低频rTMS 干预癫痫大鼠模型前后的表达变化情况 使用Western Blot 检测各组全长型TrkB 受体（the full-length TrkB receptor，TrkB.FL）和截短型TrkB 受体（the truncated TrkB receptor，TrkB.T）蛋白表达的变化。与对照组相比，癫痫组TrkB.FL 受体表达降低（P＜0.05，图2A）。而经低频rTMS 干预后（Status Epilepticus+rTMS），其与癫痫组相比TrkB.FL 受体表达升高（P＜0.05），但仍低于对照组（P＜0.05，图2A）。在癫痫假干预组中（Status Epilepticus+Sham），TrkB.FL 受体表达与癫痫组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

与对照组相比，癫痫组TrkB.T 受体表达升高（P＜0.05）；经低频rTMS干预后，TrkB.T受体表达降低（P＜0.05），但仍高于对照组（P＜0.05，图2B）。在癫痫假干预组中，TrkB.T 受体表达与癫痫组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。总之，癫痫大鼠模型中TrkB.FL 受体表达降低，而TrkB.T 受体表达升高，但经低频rTMS 干预模型后，可上调低表达的TrkB.FL 受体，下调高表达的TrkB.T 受体。

图2 低频rTMS 干预癫痫大鼠模型前后TrkB 受体蛋白表达的变化Fig.2 Changes of TrkB receptor protein expression before and after low frequency rTMS intervention in epileptic rats

2.3 TrkB.FL 信号通路在低频rTMS 干预癫痫大鼠模型前后的活性变化情况 实验采用磷酸化的TrkB.FL 受体蛋白（phosphorylated TrkB.FL）与总TrkB.FL 受体蛋白（total TrkB.FL）的比值（pTrkB.FL/total TrkB.FL）代表TrkB.FL 信号通路的激活程度。与对照组相比，癫痫组磷酸化TrkB.FL 受体比值降低（P＜0.05，图3）。经低频rTMS 干预后与癫痫组相比，磷酸化TrkB.FL 受体比值升高（P＜0.05，图3）。但在癫痫假干预组中，磷酸化TrkB.FL 受体比值与癫痫组相比差异仍无统计学意义（P＞0.05）。结果表明TrkB.FL 信号通路活性在癫痫状态下受到抑制，但经低频rTMS 干预后，TrkB.FL 信号通路可被重新激活。

2.4 低频rTMS 干预癫痫大鼠模型前后神经元放电的变化情况 上述实验结果表明癫痫组神经元放电频率较对照组明显升高，而癫痫组经低频rTMS 干预后，神经元放电频率（1.40 ± 0.13）Hz较癫痫组（1.88 ± 0.21）Hz 明显降低（P＜0.05），但仍低于对照组（0.45±0.03）Hz（P＜0.05，图4）。在癫痫假干预组中，神经元放电频率（1.84±0.36）Hz与癫痫组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。结果提示低频rTMS 干预可抑制癫痫大鼠的痫样放电。

图3 低频rTMS 干预癫痫大鼠模型前后，磷酸化TrkB.FL受体蛋白（phosphorylated TrkB.FL）与总TrkB.FL 受体蛋白（total TrkB.FL）表达变化Fig.3 Changes in phosphorylated TrkB.FL receptor protein（phosphorylated TrkB.FL）and total TrkB.FL receptor protein（total TrkB.FL）before and after lowfrequency rTMS intervention in epileptic rats

图4 低频rTMS 干预癫痫大鼠模型前后，神经元放电活动的变化Fig.4 Changes in neuronal discharges before and after lowfrequency rTMS intervention in epileptic rats

3 讨论

研究表明低频rTMS（90%rMT）可降低难治性癫痫患者发作间期痫样放电频率，还可以改善这些患者的心理状况［10］；使用8 字形线圈低频rTMS可有效治疗小儿难治性癫痫［11］。而本实验也表明大鼠癫痫模型经低频rTMS（1 Hz）干预后，痫样放电频率大幅度降低（图4），则再一次证明低频rTMS治疗癫痫是有效的，但分子机制仍未有定论。

有证据表明TrkB 受体是癫痫形成过程中的一个重要分子，如敲除大鼠海马TrkB 受体基因后，则癫痫点燃模型中的癫痫形成会被抑制［12］。TrkB 受体分为TrkB.FL 和TrkB.T 两种亚型，但两种亚型在癫痫中的表达并不平衡，在大鼠癫痫持续状态下，TrkB.FL 表达和磷酸化的水平显著降低，但TrkB.T表达并无改变［13］。而本实验同样发现两种亚型表达失衡，即TrkB.FL表达下调而TrkB.T表达上调（图2）。在大鼠原代神经元痫样放电模型中，使用翻译抑制剂降低原本高表达的TrkB.T 后，模型的痫样放电频率显著降低［14］。同样，本研究采用低频rTMS干预癫痫大鼠模型后，可上调低表达的TrkB.FL，下调高表达的TrkB.T（图2），此外模型的自发放电频率明显下降（图4）。该结果一方面说明维持TrkB受体亚型的表达平衡对癫痫的抑制至关重要；另一方面说明低频rTMS 抗癫痫作用的机制很有可能是从调整TrkB 受体表达开始的。但TrkB 受体表达变化又直接影响TrkB 信号通路，所以TrkB 信号通路也有可能参与低频rTMS抗癫痫的作用机制当中。

当BDNF与TrkB受体结合后，TrkB受体自身发生磷酰化，最终启动TrkB信号通路，在神经元分化、存活和突触可塑性等方面发挥作用。正常情况下两个TrkB.FL 同二聚体与BDNF 结合后可正常激活TrkB.FL信号通路，但TrkB.FL和TrkB.T异二聚体与BDNF结合后则抑制TrkB.FL信号通路。TrkB.FL信号通路与癫痫的形成与发展存在密切联系，但在XIANG 等［15］和本研究中（图3）均发现癫痫状态下TrkB.FL信号通路受到抑制，而恰好TrkB.T表达增加，很可能造成TrkB.T与TrkB.FL异二聚体增多，最终导致TrkB.FL 信号通路被抑制，如果重新激活TrkB.FL信号通路，则癫痫有可能被抑制［14］。经低频rTMS干预癫痫大鼠模型后，原本高表达的TrkB.T 下调，可能减少了异二聚体的形成；同时上调了低表达的TrkB.FL，最终使癫痫状态下被抑制的TrkB.FL 信号通路重新被激活，此外痫样放电频率明显降低。