龙胆苦苷预处理对过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞氧化应激损伤的影响及机制

杨凯强，刘宝辉，王玉玖，董圣军，吴恩刚，刘典晓

(滨州医学院附属医院，山东滨州256600)

内皮细胞对血管功能调节具有重要作用，内皮细胞的氧化应激损伤是动脉粥样硬化、高血压等疾病的重要发病因素[1]。诱导预适应与药物治疗是减轻机体氧化应激的常用方法。近年来，传统中药因来源广泛、不良反应少、耐药性低等优点越来越受到关注。龙胆苦苷(GPS)是龙胆科龙胆属植物龙胆的主要有效成分。研究显示，GPS不仅有抗炎止痛[2]、保肝利胆[3]、拮抗肿瘤的作用[4]，更有抗氧化[5，6]以及抑制大动脉平滑肌细胞的增殖、迁移[7]等预防和治疗动脉粥样硬化的心血管保护作用。但在保护心血管过程中,GPS对血管内皮细胞的氧化应激损伤是否具有保护作用鲜见报道。2017年11月～2018年5月，我们采用过氧化氢(H2O2)作用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)建立标准氧化应激损伤模型[8]，观察GPS预处理对HUVEC氧化应激损伤的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器 HUVEC由滨州医学院实验中心提供。GPS、噻唑蓝(MTT)、胰蛋白酶(美国Sigma-Aldrich公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，DMEM低糖培养液(美国Hyclone公司)，H2O2(天津市天大化工实验厂)，鼠源抗小鼠凋亡蛋白Caspase-3、β-actin、Bax、磷酸化AKT(p-AKT)、PI3K、B淋巴细胞/白血病-2(Bcl-2)抗体(美国Cell Signaling公司)，原位末端转移酶标记(TUNEL)检测试剂盒(美国Santa Cruz公司)，辣根过氧化物酶标记羊抗兔或鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒(南京建诚生物技术有限公司)，BCA蛋白定量测定试剂盒(上海碧云天生物技术公司)。酶标仪(美国Biotech公司)，荧光显微镜(日本Olympus公司)，Western blotting发光照相系统(美国Rio-Red公司)。

1.2 细胞培养与分组处理 将HUVEC加入含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液，置于37 ℃、5% CO2培养箱内培养2～3 d，至细胞贴壁融合。加入0.25%胰蛋白酶消化，传代培养。取对数生长期细胞，随机分为正常对照组、模型组和GPS干预组。模型组加入200 μmol/L H2O2(以DMEM稀释)培养4 h，建立氧化应激损伤模型；GPS干预组先加入20 μmol/L GPS(用DMSO预溶，并用DMEM培养液稀释至相应浓度)培养12 h，然后加入200 μmol/L H2O2培养4 h；正常对照组仅加入0.01% DMSO培养4 h。

1.3 细胞存活率检测 采用MTT法。取各组反应后细胞，PBS冲洗，加入DMEM培养液100 μL和含0.5% MTT的培养液10 μL，37 ℃、CO2培养箱内孵育4 h。弃培养液，加入100 μL DMSO原液，振荡10 min，待结晶完全溶解后，用酶标仪于570 nm和630 nm波长处测定吸光度(A)值。细胞存活率=[(实验组A570-实验组A630)/(正常对照组A570-正常对照组A630)]×100%。

1.4 细胞凋亡率检测 采用TUNEL法。取各组反应后细胞，加入4%多聚甲醛固定1 h。采用双重染色法，加入TUNEL染液后，荧光显微镜下凋亡细胞的细胞核呈绿色，而DAPI染液可沾染到所有凋亡和未凋亡细胞的细胞核，镜下呈蓝色。每组细胞随机选择5个视野进行计数。细胞凋亡率=凋亡细胞数/所有细胞数×100%。

1.5 细胞上清液中MDA含量及SOD、GSH-Px活性检测 各组细胞完成反应后，吸取细胞上清液。采用NBT法测定SOD活性，用TBA在酸性条件下加热与组织中的MDA产生显色反应来计算MDA含量，通过测定340 nm光吸收减少速率来计算GSH-Px活性。均严格按照试剂盒说明书操作。

1.6 细胞中PI3K/AKT信号通路蛋白PI3K、p-AKT以及凋亡相关蛋白Caspase-3、线粒体凋亡通路相关蛋白Bax、Bcl-2表达检测 采用Western blotting法。取各组反应后细胞，加入裂解缓冲液裂解，提取细胞总蛋白，采用BCA蛋白定量测定试剂盒测定蛋白浓度。取20 μL总蛋白与SDS缓冲液充分混合后，沸水中煮7 min，使蛋白充分变性。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离，电转移至硝酸纤维素膜上，用含50 g/L脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h。依次滴加抗PI3K、p-AKT、Bax、Bcl-2、Caspase-3、β-actin抗体(均按1∶1 000稀释)，4 ℃过夜。TBST洗涤，加入1∶5 000的辣根过氧化物酶标记羊抗兔或鼠IgG孵育2 h，TBST洗涤。ECL发光液显影、曝光、定影，Bio-Rad系统拍照，并用其附带的软件分析目标蛋白的相对表达量，内参蛋白为β-actin。

2 结果

2.1 各组细胞存活率和凋亡率比较 与正常对照组相比，模型组细胞存活率降低，凋亡率升高(P均<0.01)；与模型组相比，GPS干预组细胞存活率升高，凋亡率降低(P<0.01)。见表1。

表1 各组细胞存活率和凋亡率比较

注：与正常对照组相比，*P<0.01；与模型组相比，#P<0.01。

2.2 各组细胞上清液中MDA含量及SOD、GSH-Px活性比较 与正常对照组相比，模型组MDA含量升高，SOD、GSH-Px活性降低(P均<0.01)；与模型组相比，GPS干预组MDA含量降低，SOD、GSH-Px活性上升(P均<0.01)。见表2。

表2 各组细胞中MDA含量及SOD、GSH-Px活性比较

注：与正常对照组相比，*P<0.01；与模型组相比，#P<0.01。

2.3 各组细胞中PI3K、p-AKT、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达比较 与正常对照组相比，模型组PI3K、p-AKT、Bcl-2表达降低，Bax、Caspase-3表达升高(P均<0.01)；与模型组相比，GPS干预组PI3K、p-AKT、Bcl-2表达升高，Bax、Caspase-3表达降低(P<0.05或<0.01)。见表3。

表3 各组细胞中PI3K、p-AKT、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达比较

注：与正常对照组相比，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01。

3 讨论

血管内皮细胞是位于血液和组织之间的主要生理屏障，不仅能够维护心血管系统生理平衡，还可促使免疫细胞进入血管和周围组织，进而促进组织中黏附分子和趋化因子表达，在血管内分泌调节中起调控作用[9]。氧化应激诱导的血管内皮细胞功能紊乱是多种心血管与非血管疾病共同的病理基础[10]。研究发现，在内皮细胞氧化应激损伤过程中，活性氧簇(ROS)可引起凋亡通路相关蛋白Bax、Caspase-3表达升高，干扰正常状态中抗凋亡蛋白Bcl-2的作用，从而引起血管内皮细胞存活率下降，诱导内皮细胞凋亡[11]。因此，抑制或清除过量的ROS对保护血管内皮细胞具有重要意义。现已证实，多种信号通路能够抑制氧化应激发生，其中PI3K/AKT信号通路具有重要的抗氧化作用[13，14]。GPS属于裂环环烯醚萜苷类化合物，其分子式是C16H20O9。研究显示，GPS具有保护心血管的作用。Kesavan等[7]报道，GPS可抑制大动脉平滑肌细胞的增殖、迁移；曹慧敏等[12]报道，GPS可减轻缺血再灌注所致的心肌细胞凋亡。其机制可能为：GPS抑制趋化物甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸、十四酰佛波乙酸酯和花生四烯酸诱导的过氧化物酶的产生，并抑制酪氨酰和丝氨酸/苏氨酸磷酸化的作用，同时抑制细胞质蛋白向细胞膜的迁移。GPS对H2O2诱导的血管内皮细胞氧化应激损伤是否存在保护作用缺少深入的研究。

本研究结果显示，H2O2作用于HUVEC后，可显著降低细胞内SOD、GSH-Px活性，增加MDA含量，表明H2O2使细胞受到严重的氧化应激损伤。在使MDA生成增多的同时，损害了细胞的自我防御和自净功能，导致SOD生成减少和ROS含量增多。应用GPS预处理后，细胞存活率升高，凋亡率降低。与模型组相比，GPS干预组MDA含量明显降低，SOD、GSH-Px活性显著上升，表明GPS具有良好的清除细胞内氧化毒性物质的能力，对氧化应激损伤的HUVEC存在一定的保护作用。进一步研究发现，与模型组相比，GPS干预组AKT磷酸化水平明显上调，PI3K、Bcl-2蛋白表达增加，凋亡蛋白蛋Bax表达降低，Caspase-3的激活受到抑制。提示GPS对HUVEC的抗氧化保护作用可能与PI3K/AKT信号通路相关。

综上所述，在H2O2造成的HUVEC氧化应激损伤过程中，GPS能够抑制氧化应激水平，上调抗凋亡蛋白Bcl-2并抑制凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达，从而减少内皮细胞凋亡，发挥保护内皮细胞的作用；其机制可能与激活PI3K/AKT信号通路有关。