血流感染肺炎克雷伯菌pLVPK毒力质粒的分布及与耐药的关系

黄先琪 杜芳玲 魏丹丹 张伟 刘洋,* 万腊根

(1 南昌大学公共卫生学院，南昌 330006；2 南昌大学第一附属医院，南昌 330006)

肺炎克雷伯菌是在医院感染和社区环获得性感染中的一种重要的人类病原体，可引起肝脓肿、血流感染、尿路感染等多种感染[1-2]，尤其是危重症患者[3]。近年来，随着抗生素的广泛应用及侵入性诊疗技术的广泛开展，肺炎克雷伯菌引起的血流感染呈现出增长的趋势，严重威胁患者的生命[4]。有研究表明[5]， 肺炎克雷伯菌引起血流感染尤其是高毒力肺炎克雷伯菌血流感染患者死亡率高，且医疗费用昂贵。毒力质粒pLVPK是高毒力肺炎克雷伯菌发挥毒力作用的重要因素，而毒力质粒pLVPK相关基因(terW+-iutA+-rmpA+silS+)是脓肿形成的独立危险因素[6]。本研究主要对血流感染肺炎克雷伯菌的毒力质粒pLVPK的分布情况及毒力基因携带进行研究，并探讨其与耐药及耐药基因携带的关系。

1 材料与方法

1.1 菌株来源及鉴定

收集2016年1月—2017年6月南昌大学第一附属医院分离96株血流感染的肺炎克雷伯菌作为实验菌株，并剔除了同一个患者相同部位的重复菌株。采用Vitek-Compact全自动细菌鉴定仪进行生化鉴定及药敏试验检测。

1.2 检测方法

1.2.1 荚膜血清分型及毒力基因检测

热裂解法提取菌株DNA。采用PCR方法筛选所有肺炎克雷伯菌的高毒力荚膜血清型基因(K1、K2、K5、K20、K54和K57)，并对其进行PCR扩增8种常见毒力基因(rmpA、rmpA2、aerobactin、iutA、mrkD、iroN、magA和wcaG)，PCR的扩增引物、体系和扩增条件参照相关文献进行[7-8]。

1.2.2 药敏试验和耐药基因检测

采用Vitek-Compact全自动微生物分析仪开展体外药物敏感性试验，对敏感、中介、耐药的解释标准参照美国临床实验室标准化研究所(2017年)规定的标准。PCR扩增检测13种耐药基因，其中4种碳青霉烯酶基因(blaVIM、blaNDM、blaKPC和blaOXA-48)、3种β-内酰胺酶基因(blaSHV、blaTEM和blaCTX-M)、2种16rRNA甲基化酶基因(rmtB、armA)和4种PMQR基因(qnrA、qnrB、qnrS、acc(6')-Ib-cr)，PCR的扩增引物、体系和扩增条件参照相关文献进行[9-10]。

1.2.3 pLVPK相关基因检测

PCR扩增检测terW、iutA、rmpA和silS 4个基因，PCR的扩增引物、体系和扩增条件参照相关文献进行。根据参考文献[11]，将terW+-iutA+-rmpA+silS+定义为毒力质粒pLVPK阳性菌株，其余为毒力质粒pLVPK阴性菌株。

1.2.4 pLVPK质粒的S1-PFGE及Southern blot

以rmpA2基因设计探针，参照参考文献先对携带pLVPK质粒的菌株进行S1-PFGE及Southern Blot检测[6]。

1.2.5 统计分析

使用SPSS 21.0统计软件进行统计分析，根据是否携带pLVPK分组，对其荚膜血清分型、毒力基因、抗菌药物的耐药性及耐药基因进行比较。使用χ2检验进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血流感染肺炎克雷伯菌毒力质粒pLVPK的分布及其与荚膜血清分型的关系(表1)

血流感染肺炎克雷伯菌中毒力质粒pLVPK携带率39.6%。毒力质粒pLVPK阳性菌株K1荚膜血清分型率显著高毒力质粒pLVPK阴性菌株，而在其他非高毒力荚膜血清分型上，毒力质粒pLVPK阳性菌株显著低于毒力质粒pLVPK阴性菌株。同时我们采用S1-PFGE及Southern Blot验证了毒力质粒pLVPK的存在，如图1所示。

2.2 血流感染肺炎克雷伯菌的毒力基因分布

除allS基因全阴外，毒力质粒pLVPK阳性菌株毒力基因的携带率均显著高于毒力质粒pLVPK阴性菌株。毒力基因分布见表2。

2.3 血流感染肺炎克雷伯的药敏结果与毒力质粒的关系

除酶复合制剂哌拉西林/三唑巴坦外，其余抗菌药物中毒力质粒pLVPK阳性菌株耐药率均显著低于毒力质粒pLVPK阴性菌株(P＜0.05)。此外，我们还在毒力质粒pLVPK阳性菌株中发现产ESBL率高达42.11%，对碳青霉烯类抗生素耐药率也高达15.79%，详见表3。

表1 血流感染肺炎克雷伯菌毒力质粒分布与荚膜血清型的关系Tab.1 Relationship between the distribution of virulence plasmid and capsule serotype of Klebsiella pneumoniae causing bloodstream infection

图1 以毒力质粒rmpA2为靶标基因对毒力质粒pLVPK的S1-PFGE及Southern bolt图Fig.1 S1-PFGE and Southern hybridisation of the marker gene of the virulence plasmid rmpA2

表2 血流感染肺炎克雷伯菌的毒力基因分布与毒力质粒携带的关系Tab.2 Relationship between virulence gene distribution and virulence plasmid in Klebsiella pneumoniae causing bloodstream infection

2.4 血流感染肺炎克雷伯菌耐药基因及其与毒力质粒携带的关系

毒力质粒pLVPK阳性菌株blaKPC、blaTEM、rmtB、qnrB及acc(6')-Ib-cr基因的携带率显著低于毒力质粒pLVPK阴性菌株，如表4所示。

表3 血流感染肺炎克雷伯菌的药敏结果及与毒力质粒关系Tab.3 The relationship between the drug sensitivity and the virulence plasmid of Klebsiella pneumoniae causing bloodstream infection

表4 血流感染肺炎克雷伯菌耐药基因携带与毒力质粒的关系Tab.4 Relationship between drug resistance genes and virulence plasmid of Klebsiella pneumoniae causing bloodstream infection

3 讨论

肺炎克雷伯菌是造成些年来医院感染和社区获得性感染最常见的病原体之一，其造成的血流感染直接危及患者的生命[12]。近年来，高毒力肺炎克雷伯菌不断报道，已经逐渐成为全球性感染病原体[13]。随着抗菌药物的广泛应用，耐药已经成为了高毒力肺炎克雷伯菌治疗的一大难题，也直接影响了患者的治疗费用和预后。

毒力质粒pLVKP是首次从高毒力肺炎克雷伯菌CG43上分离得到的213kb的质粒[14]，包括CPS合成调节基因rmpA2和rmpA，铁摄入系统基因iucABCD、iutA、iroBCDN、fepBC和fecIRA，金属抗性基因(如银抗性基因silS、亚碲酸盐抗性基因terW等)。现有报道发现terW+-iutA+-rmpA+silS+作为pLVPK质粒的代表性基因及衍生物，可有效的指示高毒力质粒pLVPK的存在[6]。毒力质粒pLVPK直接影响高毒力肺炎克雷伯菌的毒力，在高毒力肺炎克雷伯菌的致病中发挥重要作用，然而其在血流感染肺炎克雷伯菌中的分布及其与耐药性的关系尚未见报道。本研究我们从临床分离96株血流感染的肺炎克雷伯菌中筛选高毒力质粒pLVPK的存在情况，并结合其耐药性与毒力基因携带，探究毒力质粒pLVPK在高毒力肺炎克雷伯菌致病及耐药中的作用。

本研究发现除了allS和mrkD外，毒力质粒pLVPK阳性肺炎克雷伯菌对其他毒力基因(rmpA、rmpA2、magA和iutA等)的携带率均显著高于pLVPK质粒阴性菌株。这表明毒力质粒pLVPK的存在有助于血流感染肺炎克雷伯菌毒力基因的携带，抑或毒力质粒pLVPK易存在于携带多种毒力基因的血流感染肺炎克雷伯菌中。在这些差异的毒力基因中，我们发现部分毒力基因如rmpA2、iroN及iutA等存在于毒力质粒pLVPL上，但也有部分毒力基因如rmpA、magA、wcaG等则存在于染色体上，这也表明毒力质粒pLVPK还可影响毒力基因的携带。在耐药上，除酶复合制剂外，毒力质粒pLVPK阳性菌株的耐药均显著低于毒力质粒pLVPK阴性菌株。这与以往的报道相似[15]，表明毒力质粒pLVPK的携带会干扰耐药性的形成，但本研究在毒力质粒阳性菌株中我们仍发现部分耐药菌株的存在，甚至有部分菌株为碳青霉烯类耐药菌株的存在，需要引起临床的重视[16]。针对其耐药基因检测研究也发现，在blaKPC、blaTEM、rmtB、qnrB及acc(6')-Ib-cr基因的携带上，毒力质粒pLVPK阳性菌株均显著低于毒力质粒pLVPK阴性菌株。但在毒力质粒pLVPK阳性的菌株中我们也发现了如KPC基因等耐药基因的存在，表明相关质粒介导的耐药基因也已播散至高毒力肺炎克雷伯菌株中，应引起临床及院感的高度重视[17-18]。

综上所述，毒力质粒pLVPK的携带直接影响高毒力肺炎克雷伯菌的毒力基因携带及耐药特征，毒力质粒pLVPK常存在于K1荚膜血清分型菌株，其耐药基因的携带虽然较毒力质粒阴性菌株低，但也出现了blaKPC等多种耐药基因携带的毒力质粒阳性菌株，需引起临床的重视，防止高毒力高耐药肺炎克雷伯菌的暴发流行。