免疫分析技术在四环素类抗生素残留检测中的应用

■曹金博 王 耀 胡骁飞 邓瑞广 李燕虹 孟继秋 古绍彬*

（1.河南科技大学食品与生物工程学院 食品加工与安全国家级实验教学示范中心河南省食品原料工程技术研究中心，河南洛阳471023；2.河南省农业科学院农业部动物免疫学重点实验室河南省动物免疫学重点实验室，河南郑州450002）

四环素类抗生素是由放线菌产生的一类广谱性抗生素，对大多数革兰氏阳性菌和阴性菌可起到抑制杀菌的作用，如葡萄球菌、芽孢杆菌、肺炎杆菌、溶血性链球菌、立克次氏体等[1]。因此，被广泛的用于治疗各种感染性疾病，而微量添加在饲料或动物饮水中则可用于预防疾病，提高饲料的利用率，促进动物生长等[2-3]。四环素类抗生素因其广谱的抑菌效果以及低廉的价格，是目前世界上使用最广泛、用量最大的抗生素之一。但近年来，四环素类抗生素在禽畜养殖中的违规滥用现象非常严重[4]，药物使用不规范以及无休药期，导致四环素类抗生素在动物源性食品中大量残留，并最终在人们食用之后蓄积在体内，严重危害人身健康[5]。同时动物体内未被吸收的一部分四环素类抗生素以母体化合物的形态排出体外，进入环境中之后难以降解，除造成化学污染外，还可诱导抗性基因和抗性微生物的产生，进而危害人类健康[6-7]。因此，为加强我国动物性食品安全检测，建立简单快速、灵敏度高、特异性强的四环素类抗生素残留检测方法十分必要。

1 四环素类抗生素概述

1.1 性质及其作用机制

四环素类抗生素（Tetracyclines，TCs）是由放线菌等产生的一种能够抑制、杀灭大多数革兰氏阳性菌和阴性菌等病菌的广谱抗菌剂，TCs 主要包括天然合成的四环素（Tetracycline，TC）、金霉素（Chlor⁃tetracycline，CTC）、土霉素（Oxytetracycline，OTC），以及化学半合成的强力霉素（Doxycycline，DC）等[8]，其基本结构式如图1 所示，都具有相似母体结构，不同之处在于取代基的不同，具体见表1。四环素类抗生素呈黄色粉末状，水溶性较差，遇光易分解，因含有酚羟基、烯醇羟基以及二甲氨基，属于酸碱两性化合物[9]。

图1 四环素类抗生素基本化学结构

表1 主要四环素类抗生素具体取代基

四环素类抗生素作为一种快速的抑菌剂，在高浓度状态下杀菌效果显著，其作用机制主要有以下三点：一是四环素类抗生素与细菌核糖体30s 亚基上的受体特异性结合，从而阻止相应的tRNA 在该位点上的结合，最终抑制蛋白质的合成[10]；二是四环素类抗生素通过改变细胞膜的通透性，导致参与DNA 复制的核苷酸以及其他一些重要的成分外漏，从而无法完成DNA 复制和蛋白质的表达，最终起到抑制和杀死细菌的作用[11]；三是目前增加的一种新的解释，四环素类抗生素能够干扰延伸因子（Tu），影响其与核糖体之间的相互作用，或者是在反密码子识别密码子时破坏了Tu与tDNA的作用[12]。

1.2 危害及限量标准

目前，四环素类抗生素主要应用在禽畜养殖以及水产养殖中，但其在动物源性产品以及环境中大量残留，随之带来的危害以及负面效应也逐渐凸显出来。造成大量残留的原因有以下三点：一是养殖者不按照规范用药，为短时间内控制病情加大四环素类抗生素的使用量；二是为掩盖禽畜病态，在休药期仍然继续使用药物；三是为控制用药成本，使用来源不明的抗生素[13]。

四环素类抗生素的蓄积毒性对人体危害极大，据报道，四环素类抗生素可聚积在骨骼内，严重影响身体的发育，同时与牙齿中的钙结合成难溶黄色钙化物，形成所谓的“四环素牙”[14]；肝和肾是人体的解毒器官，四环素类抗生素的大量蓄积可严重损害肝肾功能，引起脂肪肝变性和肾功能不全[15]；四环素类抗生素的存在也会导致人体正常菌群的失衡，引发一些呼吸道、消化道和尿道感染；同时，四环素类抗生素也会引起过敏反应，诱发二重感染以及一些胃肠道反应[16]。因此，我国农业部235 号公告对动物源性食品中四环素类抗生素最高残留限量做出规定，详见表2。

表2 主要四环素类抗生素最高残留量

2 免疫分析技术

免疫分析技术利用高亲和力抗体对抗原进行特异识别，并且随着技术的成熟与发展，逐渐引入放射性同位素、荧光素、酶、纳米发光材料等标记抗原或抗体，从而在检测的特异性和灵敏度方面大大提高[17]。目前，已经应用到四环素类抗生素残留的检测的免疫分析技术主要有放射免疫法（RAI）、酶联免疫法（ELI⁃SA）、胶体金免疫层析法（IGCA）、电化学免疫法（LCE⁃CIA）、荧光免疫分析法（FIA）等。以上五种免疫分析方法，在不同领域均已得到广泛应用，其检测原理、优缺点及适用范围详见表3。

2.1 放射免疫法

放射免疫法是一种较早的标记免疫分析检测技术，它利用放射性同位素标记的抗原同待检样品中的抗原竞争性的与抗体反应，最后通过分离测量放射性强度，来间接地反映样品中抗原的含量[18]。苏明明等[19]利用放射免疫分析方法对采集的6 个牛血清样品进行四环素残留检测，其检测限为20 μg/kg，该方法操作简单、特异性强，可短时间内得到检测结果，但作为一种初筛方法，当检测出阳性结果时，还需采用其他检测方法进行确证。Meyer等[20]采集了13个来自不同州的湖泊水样，以及52 个禽畜养殖密集区的地表水和地下水样品，用改进的放射免疫法对样品中四环素类抗生素残留进行检测，检测结果表明：13 个湖泊水样均呈阳性，而地表水和地下水的52 个样品中仅两个成阴性，且这两份阴性样品中四环素类抗生素浓度均低于1 μg/kg，用液相色谱-质谱法对其进行验证，结果显示放射免疫法的灵敏度比液相色谱-质谱法高1.5倍。放射免疫法采用放射性同位素对抗原进行标记，其灵敏度大大提高，显著缩短了检测时间，但其产生的放射性污染难以处理，这也极大地限制的放射免疫分析方法的普及和应用。

表3 各种免疫分析方法对比分析

2.2 酶联免疫法

酶联免疫法是一种经典的免疫分析方法，可实现对多种危害物的定性和定量分析[21]。四环素类抗生素属于小分子危害物，对其进行检测时多采用ELISA 方法的间接竞争模式，如图2 所示，它利用抗原和抗体的特异结合的能力，首先将包被抗原固定在固相载体上，然后将待检样品和一抗混合与固相载体上的包被抗原反应，洗去游离成分之后加入酶反应底物引发显色反应，最后根据颜色反应深浅和酶标仪所测吸光度值来进行定量或定性分析[22]。Yanni 等[23]基于制备的高敏感的抗四环素类抗生素单克隆抗体，建立ELISA 方法用于检测牛奶和蜂蜜中的四环素（TC）、土霉素（OTC）、金霉素（CTC）。检测结果显示：TC、OTC、CTC 的半数抑制浓度（IC50）分别为0.72、3.2、6.4 μg/l；牛奶中回收率分别为：82%～102%、91%～105%、90%～101%，蜂蜜中回收率分别为：88%～101%、89%～101%、89%～95%。此方法可迅速、灵敏的检测出牛奶和蜂蜜中的TC、OTC、CTC。Zhan 等[24]开发了一种TC 残留检测ELISA 试剂盒，IC50为0.293 ng/ml，灵敏度为0.05 g/ml，检出限为3～5 g/ml，变异系数（CV%）均小于15%，与CTC 的交叉反应活性大于60%，与其他抗生素无交叉反应，此试剂盒不仅灵敏度高、特异性强，而且保存时间较长，4 ℃条件下可保存6 个月以上。刘智宏等[25]则建立了一种四环素类药物多残留酶联免疫检测试剂盒，该试剂盒的检测限更低为0.3 μg/l，并且可同时测定四环素、金霉素、土霉素和强力霉素4 种药物残留，其灵敏度以及精确度均能达到四环素类抗生素残留检测的要求。

2.3 胶体金免疫层析法

胶体金免疫层析法是基于抗原抗体特异性结合反应以及胶体金标记技术发展起来的一种新的免疫分析检测方法[26]。利用该方法组装的胶体金免疫层析试纸可分为：抗原检测试纸（双抗夹心法）、半抗原检测试纸（竞争法）以及抗体检测试纸。针对小分子物质进行检测时，多采用半抗原检测试纸[27]，其结构如图3 所示，主要包括样品垫、结合垫、检测线、质控线以及吸水垫等结构。检测时可通过观察检测线和质控线显色情况进行定性或定量分析[28]。。付云洁等[29]基于竞争原理，利用所制备的单克隆抗体建立了食品中金霉素残留的胶体金免疫层析试纸，该试纸检测限为0.7 μg/ml，检测时间仅需5 min，但当食品中存在四环素且浓度大于1.0 μg/ml 时，与金霉素存在交叉反应。檀尊社等[30]同样基于所制备的单克隆抗体研发了一种胶体金免疫层析试纸用于快速检测水产样品中四环素药物残留，该试纸的检测限大大降低，为100 ng/ml。与金霉素、土霉素、强力霉素等四环素族抗生素有很强的交叉反应，故可用于同时检测四环素类抗生素药物残留。高楠[31]用所建立的四环素胶体金免疫层析试纸来检测牛奶、猪肉、牛肉、鸡肉、鱿鱼、大眼鲷鱼等食品中的四环素，结果表明，牛奶样品的检测限为40 μg/l，而其余几种样品的检测限为80 μg/kg，与ELISA 方法相比，具有更高的灵敏度和特异性，且操作简单、快速、结果稳定，可作为四环素残留的现场监控筛检手段。

图2 间接竞争ELISA原理图

图3 胶体金免疫层析试纸结构图

2.4 电化学免疫传感器法

电化学免疫传感器法是一种结合免疫分析技术和电化学分析技术所研发的一种标记免疫快速检测方法[32]。与其他免疫技术相比，它在抗原或抗体上标记了电化学反应试剂，在于待检物中相应靶标物质特异性结合前后，会产生电化学信号变化，最终通过放大指示器显示[33]。该传感器既具有免疫检测良好的特异性，又具有电化学分析的高灵敏度，同时制备简单，便于操作，无放射污染，并可实现实时在线检测[34]。Liu等[35]以壳聚糖作为连接剂，将四环素单克隆抗体固定在四氧化三铁（Fe3O4）纳米颗粒修饰的电极上，制备了一种简单、灵敏的电化学免疫传感器，在对牛奶中四环素检测时，检测限为0.032 1 ng/ml，并且在0.08～1 ng/ml范围内呈良好的线性电流响应。郑舒[36]则基于三电极体系的电化学传感器，采用五氧化二铌（Nb2O5）作为工作电极，壳聚糖和磁纳米粒子作为修饰材料，修饰在Nb2O5表面，最后将四环素单克隆抗体修饰在其表面，建立了一种电化学免疫传感器，用于检测牛奶中四环素残留，原理如图4所示。该传感器在0.04～1 ng/ml 的范围内呈良好的线性关系，最低检测限为0.022 4 ng/ml，样品回收率为：95.40%～110.0%。用ELISA 方法进行验证的结果和该免疫传感器的检测结果相似，说明其检测结果准确、可靠，具有很高的实际应用价值。

图4 电化学发光免疫传感器原理图

2.5 荧光免疫分析法

荧光免疫分析法是荧光标记技术和免疫分析技术相结合的一种新型免疫检测方法，该方法灵敏度高，抗干扰能力强，可对重金属、兽药残留、生物毒素、重金属等进行超痕量检测[37]。荧光免疫分析法有竞争型和夹心型两种模式，对小分子进行检测时多采用其竞争模式，其竞争原理基于未标记抗原和标记抗原竞争性的与抗体结合，最后根据反应液荧光强度间接测定样品中抗原含量[38]。唐海波等[39]以荧光纳米微球颗粒标记抗体，建立的免疫层析检测方法可实现鲜奶中四环素类抗生素的总含量检测，该方法对四环素的检测下限为10 μg/l，对金霉素、土霉素、强力霉素回收率均达70%以上，且与其他药物无交叉反应。李研东等[40]采用量子点标记抗体，建立了检测四环素类抗生素残留的量子点荧光免疫分析方法，IC50为0.9 μg/l，四环素、金霉素、土霉素的最低检出限分别为3.0、2.0 μg/kg 和6.0 μg/kg，样本添加回收率在78.7%～97.0%，与传统的ELISA 方法相比，具有更高的准确度和可靠性。Chen 等[41]开发了一种基于近红外的荧光免疫检测方法，可同时用于检测四种抗生素（β-内酰胺类、四环素、喹诺酮类和磺胺类），其中对四环素的检测限为2 ng/ml，回收率为93.7%～108.2%，变异系数小于16.3%，该方法检测限更低，结果更精确。

3 小结

四环素类抗生素种类繁多，具有不稳定、流动性强等特点，在禽畜及水产养殖中的滥用现象严重，对我国动物性食品安全监控带来了极大挑战。目前，高效液相色谱法、气相色谱-质谱法等仪器检测方法已能够实现对四环素类抗生素的精准检测，且选择性强、分辨率高、假阳性低，但此类方法在样品采集和运输过程中可能会导致样品分解，检测不及时，且样品前处理复杂、操作繁琐，不适合现场实时筛查。相比之下，免疫分析方法利用高亲和力抗体对抗原进行识别，灵敏度高、特异性强且在大批量样品以及现场筛查方面具有极大地优势，但存在容易出现假阴性与假阳性结果等缺点，因此在特异性抗体的制备方面还需进一步优化和完善。随着免疫分析技术的不断发展，未来将有更多检测技术以及具有生物标记、示踪成像功能的新材料应用其中，使其不断的完善。因此，免疫分析技术在食品安全快速检测中将占有越来越重要的地位，为我国动物性食品安全提供更有利的技术支撑。