高效液相色谱法测定饲料及饲料添加剂中维生素B12新方法的研究

■贺习文 李 宏 赵彩会 高勤叶 马 川 李易轩 黄姣姣

（1.陕西秦云农产品检验检测有限公司，陕西渭南714000；2.农业农村部饲料质量监督测试中心（西安），陕西西安710016）

维生素B12又叫钴胺素，是B 族维生素中迄今为止发现比较晚的一种，也是所有维生素分子中结构最大和最复杂的物质。该分子的主要成分由一个以钴作为中心元素的卟啉环组合，一个氰基(-CN)与钴相连，4个还原的吡咯环连在一起成为1个咕啉大环（与卟啉相似）是维生素B12分子的核心。因此含这种环的化合物都被称为类咕啉，含有3 价钴的多环化合物。有钴元素存在，该化合物也被叫做“氰钴胺”，是商业上通用维生素形式，自然界少有。与钴相连的氰基，可能被一个羟基取代生成羟基钴胺素，这也是自然界中一种普遍存在的维生素B12的形式。这个氰基也可能被一个亚硝基(-NO2)取代，从而产生出(亚)硝(酸)钴胺素，它存在于某些细菌中[1]。

维生素B12能参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血，防止大脑神经受到损害等良性作用。但由于B族维生素的特性，维生素B12不可过量使用，否则会产生毒副作用，如出现哮喘、荨麻疹、湿疹、面部浮肿、寒颤等过敏反应，还可能出现神经兴奋和心悸等不适感，更会导致体内叶酸的缺乏。

饲料作为养殖动物最主要的食物来源，其主要成分一直是生产企业、养殖户和饲料监管部门所关注的重点，相关研究表明，维生素B12只有自然界的微生物能够合成，动物特别是还未健全的动物，体内合成维生素B12的能力很弱，饲料中添加维生素B12，可以防止维生素B12缺乏症的发生[2]；另据实验表明，在犊牛饲料中添加维生素B12，能够提高牛的增重和采食量，而且采食量随着添加量的增加而提高[3]。商品饲料添加剂维生素B12为1%、2%等规格，在饲料中的添加量较低，它的化学结构复杂，决定着其在饲料中的检测难度很大。所以对饲料和饲料添加剂中的维生素B12的监测就显得尤为重要。

我国现行有效的检测饲料中维生素B12的标准为GB/T 17819—2017《添加剂预混合饲料中维生素B12的测定 高效液相色谱法》[4]，检测饲料添加剂中维生素B12的标准为GB/T 9841—2006《饲料添加剂 维生素B12（氰钴胺）粉剂》[5]，该方法操作相对复杂，检测复合预混合饲料需要通过C18固相萃取柱分离，处理时间过长，整个峰走完需要2～3 min，目标峰宽大，峰型差，灵敏度不高，影响积分和计算。而GB/T 9841 中流动相中含有己烷磺酸钠，对色谱柱的寿命影响相对较大。

本文通过大量试验验证，确定以磷酸盐缓冲液+甲醇为流动相，以流动相作为提取液来对饲料及饲料添加剂中的维生素B12进行检测，结果表明，本法具有前处理简单，出峰快，峰型狭窄，稳定性好，回收率达到90%～120%之间，检出限为0.05 mg/kg等特点。

1 试验原理、材料及方法

1.1 试验原理

试样中维生素B12经提取液提取，以磷酸盐缓冲液和甲醇为流动相，注入高效液相色谱仪分离检测，外标法定量。

1.2 试验材料

1.2.1 仪器及设备

高效液相色谱仪：配备紫外检测器；十万分之一天平：梅特勒MS205DU；万分之一天平；超声波提取仪。

1.2.2 试剂及溶液

无水磷酸氢二钠（分析纯）；磷酸（优级纯）；氢氧化钠（分析纯）；甲醇（色谱纯）；维生素B12标准物质：一级水。

4 g/l氢氧化钠溶液：称取0.4 g氢氧化钠于100 ml容量瓶中，用水溶解定容。

维生素B12标准贮备液：于十万分之一天平上准确称取含量为100%的维生素B12标准物质0.025 27 g于25.00 ml 的棕色容量瓶中，用流动相溶解并定容，质量浓度为1 010.8 μg/ml。

1.3 试验方法

1.3.1 前处理方法

各类样品称重质量如下，准确称取维生素B12添加剂0.1 g，维生素预混合饲料1～3 g，复合预混合饲料3～5 g，浓缩料和配合料5 g（均准确至0.000 2 g）于25.0 ml 棕色容量瓶中，加入20 ml 左右的流动相，于超声波提取仪上超声20 min，超声提取期间旋摇两次，冷却后用流动相定容至刻度，过0.45 μm 滤膜后上机测定。

1.3.2 试验条件

色谱柱：Kromasil 100-5-C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 ml/min；柱温：室温；波长：361 nm。

2 试验结果

2.1 流动相的确定

维生素B12在强酸强碱环境下容易分解，在弱酸环境pH 值4.5～5.0 时最稳定，遇热和强光也易分解，维生素B12易溶于水、甲醇和乙醇。

根据这些性质，首先考虑相溶原理，流动相必须能够溶解目标物，即维生素B12，另外要形成一个pH值为4.5～5.0的弱酸环境，所以选用易调节pH值的磷酸盐作为流动相，0.1 mol/l磷酸二氢钠水溶液在25 ℃时pH 值为4.5，虽然是弱酸性，但是0.1 mol/l 的磷酸二氢钠溶液配制1 L需要12 g无水磷酸二氢钠，磷酸盐对于色谱柱的损害很大。综合考虑，选用了溶液呈弱碱性的磷酸氢二钠，然后用磷酸和氢氧化钠将pH值调节至4.5～5.0。

为了使目标峰的峰型好看，出峰更快，在磷酸盐缓冲液中加入甲醇，调节甲醇比例，先以磷酸盐缓冲液+甲醇=80+20（V+V）的比例，出峰30 min后，继续调节比例，磷酸盐缓冲液+甲醇=70+30（V+V），出峰时间在4.73 min左右，再调节比例为磷酸盐缓冲液+甲醇=60+40（V+V），出峰时间在3 min 左右，此时检测添加剂比较适合，但检测饲料时目标峰和部分杂峰无法分开，所以综合考虑选择70+30（V+V）的比例。

最终确定流动相为：称取4 g 无水磷酸氢二钠于1 000 ml 容量瓶中，用水溶解定容，取该溶液700 ml与300 ml甲醇混合，用磷酸和4 g/l的氢氧化钠溶液调节pH值为4.5，过0.45 μm滤膜，超声脱气。

2.2 标准曲线的配制

分别准确移取上述1.2.2中的维生素B12标准贮备液0.05、0.1、0.5、1、2、5、10 ml于10 ml的棕色容量瓶中，用流动相配制成质量浓度分别为0.505 4、1.010 8、5.054、10.108、20.216、50.54、101.08 μg/ml的标准工作液，上机测定后得到的线性回归方程为Y=20 530.7X-2 684.19，r=0.999 975 4，标准曲线如图1。

图1 维生素B12标准曲线

2.3 稳定性

取一份维生素B12添加剂和一份复合预混合饲料按1.3 中的前处理方法处理，所得试液在高效液相色谱仪上连续进样6次，所得的出峰时间和出峰面积如表1。

从表1可以看出，两份试样连续进样6次，其出峰时间和峰面积的相对标准偏差都低于0.5%，证明此方法稳定性良好。

表1 添加剂、预混合饲料的出峰时间和峰面积

2.4 回收率

另取维生素预混合饲料、复合预混合饲料、浓缩饲料、配合饲料、豆粕试样各一份，各称取4个平行样，向试样其中两份中加入1.2.2中的维生素B12标准贮备液（1 010.8 μg/ml）0.5 ml，即加标505.4 μg，4个平行样同时使用1.3中的前处理方法处理，测定结果如表2。

表2 维生素B12回收率测定

从表2可以看出，选取的维生素预混合饲料回收率为101.5%、99.2%，复合预混合饲料回收率为105.9%、97.7%，浓缩料回收率为117.1%、107.6%，配合料回收率为113.2%、109.4%，豆粕回收率为98.9%、96.8%。

选取的五种饲料及饲料原料，回收率均在90%～120%之间，但由于基质不同，维生素预混合饲料、复合预混合饲料、豆粕三种样品的回收率较好，浓缩饲料和配合饲料回收率偏高，可能原因是样品中本身含有维生素B12，含量很小，被其余杂峰干扰，难以判别维生素B12的目标峰。

2.5 最小检出限

向空白基质样品中以逐级递减的方式进行加标试验，试验发现当加标浓度为0.05 μg/g 时，目标峰峰高约为3 倍基线噪音值，则可得本方法的最小检出限为0.05 mg/kg，检出限较国标更小，适合检测的范围广，能够检测不同含量的维生素B12样品（如图2）。

图2 最小检出限0.05 mg/kg色谱图

2.6 方法结果对比

使用本方法和GB/T 17819—2017《添加剂预混合饲料中维生素B12的测定 高效液相色谱法》、GB/T 9841—2006《饲料添加剂 维生素B12（氰钴胺）粉剂》两种方法分别进行对比试验，检测同一份维生素B12添加剂样品时，本方法测定的结果为0.94%，GB/T 9841—2006 测定的结果为0.93%，两者的相对偏差为0.5%，结果在满意范围5%以内，检测同一份预混合饲料样品时，本方法测定的结果为25.1 mg/kg，GB/T 17819—2017 测定的结果为24.7 mg/kg，两者的相对偏差为0.8%，结果在满意范围5%以内。

通过试验证明，此方法可以有效检测饲料添加剂及部分饲料产品，图3、图4分别为标准品图谱和添加剂样品图谱。

图3 维生素B12标准图谱

图4 维生素B12饲料添加剂图谱

3 结论

试验证明，本方法测定饲料及饲料添加剂中维生素B12前处理简单，线性良好，相关系数达到0.999 9，稳定性好，出峰时间和峰面积的相对标准偏差均低于0.5%，回收率高，五种不同种类的饲料及饲料原料的回收率都能达到90%～120%之间，最小检出限为0.05 mg/kg，且检测数值准确，和国标检测数值的相对偏差均在满意范围内，综合以上优点，本方法值得推广使用。