短小芽孢杆菌抗菌代谢物对斑马鱼的毒性研究

■毛林静 王 莹 田佳慧 刘可春 王 慧 楚 杰*

（1.山东农业大学动物科技学院,山东泰安271018；2.齐鲁工业大学（山东省科学院）生物研究所，山东济南250014）

短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）属于芽孢杆菌属，为革兰氏阳性菌，是一类重要的生防菌，可以分泌多种抗菌素、抗菌肽和抗菌蛋白等多种抗菌物质[1]，并且这些抗菌物质的抑菌范围非常广[2]，对多种致病病原菌都有明显的抑制作用。且其繁殖速度很快，可以产生稳定芽孢[3]，可以产生极大的抗性[4]，抵抗恶劣的生存环境[5]。因此，芽孢杆菌在各个方面的实际应用都具有优势。我国畜牧业发展趋势鲜明，已经进入了新的发展阶段。农场饲养的各种动物，产生的粪便中存在着各种致病菌，不仅使畜禽患病，而且污染环境。疫病主要由致病菌造成，抑制致病菌已成为从源头治理畜禽患病的重要举措。化学杀菌剂对畜禽本身危害颇大，不宜长期使用，排入下水道也会对水体造成污染，进而威胁人类健康，而芽孢杆菌具有广谱抗菌、高效、安全、不易产生耐药性、易降解等特点，可以实现废弃物（粪便）无害化和资源化，有利于卫生防疫。

斑马鱼，又名蓝条鱼、花条鱼、斑马丹尼鱼，原产于印度、孟加拉国。由于斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87%[6]，这使得斑马鱼成为一种可以模拟人体的绝佳模式生物，可以用于多数的人体药物实验，目前已经成为遗传学和毒理学研究的重要模式生物[7-8]，斑马鱼胚胎透明，便于观察药物对其体内器官的影响。此外，其具有发育快、易于实验室饲养、繁殖量大、适应环境能力强等优点，在不喂食情况下96 h 死亡率不超过5%，以排除自然死亡的干扰，实验更具真实性，故适合用于96 h 净水实验[9]。

前期试验得出，短小芽孢杆菌发酵液对猪大肠杆菌、鸡沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌等多种致病菌均具有明显的抑制作用；但对其活性成分结构分析发现，该短小芽孢杆菌产生的抗菌活性物质属于脂醇类小分子化合物，目前，关于短小芽孢杆菌抗菌代谢物的急性毒性研究鲜有报道，本研究基于斑马鱼的诸多优点，依据《化学农药环境安全评价试验准则》进行鱼类急性毒性试验[10]。通过观察其存活情况、行为学特征及相关抗氧化酶活性指标的测定，研究该短小芽孢杆菌抗菌代谢物的急性毒性，为在畜牧业中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乙酸乙酯分析纯；LB肉汤培养基，青岛高科园海博生物技术有限公司；超氧化物歧化酶试剂盒、丙二醛试剂盒、乙酰胆碱酯酶试剂盒、超微量Na+K+-ATP酶试剂盒，南京建成有限公司；斑马鱼实验用水，山东省科学院生物研究所药物筛选平台提供。

全波长酶标仪，美国DYNEX Spectra MR(用于测定吸光度)；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；氮吹仪，上海精密仪器仪表公司；压力蒸汽灭菌筒GB 150.1-4-2011 型，上海东亚压力容器制造有限公司；振荡培养箱ZQZY-AFB 型，上海知楚仪器有限公司；低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂；数显恒温水浴锅。

1.2 受试菌株

短小芽孢杆菌（由白俄罗斯国家科学院微生物研究所引进）。

1.3 受试生物

本研究中选用斑马鱼为AB 野生品系（由山东省科学院生物研究所药物筛选平台提供），体态正常，行为活跃，平均每条体重0.8～1.0 g，雌雄随机。采用净水实验法[11]，试验前将试验用鱼先在实验室环境下饲养7 d，每日正常饲喂饲料，更换新鲜鱼水，并及时清除粪便和食物残渣。试验前24 h停止喂食，以96 h为一个周期，观察周期内鱼的行为变化。试验期间及时去除死亡鱼体，防止腐烂污染水体。

1.4 短小芽孢杆菌抗菌物质粗提物制备

短小芽孢杆菌发酵液，离心取上清液，旋蒸浓缩10 倍，根据实验室之前萃取试验条件，选择乙酸乙酯与发酵浓缩液按1∶1 萃取，萃取三次，合并萃取液，旋蒸浓缩至2～3 ml，使用氮吹仪将残留乙酸乙酯吹干，过硅胶柱，用不同梯度有机溶剂洗脱，含活性成分部分洗脱液浓缩，干燥，最后用无菌水稀释50倍制成母液，4 ℃备用。

1.5 梯度设计

根据预试验结果，斑马鱼对短小芽孢杆菌抗菌代谢物的耐受浓度为6 mg/l，因此试验设计8 个梯度（0.3、0.6、0.9、1.5、3.0、6.0 mg/l）和空白对照，每浓度组放入8尾鱼，设三个平行[12]，每组添加的鱼水和药剂总量为800 ml。

1.6 斑马鱼相关生化指标测定

暴露处理96 h后，将斑马鱼活体解剖，取头部（去除心脏）、躯干组织，在冰浴条件下按1∶9（鱼体质量分数0.9%生理盐水体积）的比例加入预冷的生理盐水，在匀浆器中匀浆，制备成10%匀浆液。匀浆液在4 ℃、15 000 r/min条件下离心20 min，上清液采用南京建成试剂盒测定超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、乙酰胆碱酯酶（AchE）和Na+K+-ATP酶的活性。

1.7 数据处理

本试验所有数据均使用SPSS 20 进行统计学显著性分析，采用单因素t 检验，认为当P＜0.05 时，具有显著性。

2 结果与结论

2.1 短小芽孢杆菌抗菌代谢物对斑马鱼形态学和死亡现象观察

试验观察，将斑马鱼放入含6 mg/l代谢物的鱼水中时，立即出现呼吸急促，鱼鳍张开并充血，且游速加快并上浮，1 h 内开始出现斑马鱼死亡，7 h 后斑马鱼全部死亡；经解剖观察，肝脏损伤严重，肠道积存黄色液体。浓度组1.5 mg/l和3 mg/l亦出现鱼的死亡，12～24 h是斑马鱼死亡的集中时间段，不同时间条件下，各浓度组斑马鱼的死亡率(死亡率=死亡试验鱼数/试验鱼总数×100%)见表1。在1.5 mg/l浓度下存活的斑马鱼经过死亡高峰期，适应环境后无异样发生，解剖得部分斑马鱼出现肝脏缺失、心包水肿等现象。在低浓度0.3、0.6 mg/l 和0.9 mg/l 下没有斑马鱼死亡。总之，代谢物中毒现象表现为呼吸急促，鳃外翻充血，并上下反复窜游，也有浮头现象出现。以上现象均说明，代谢物浓度越高，对机体损伤越大，机体应激反应越激烈。

表1 不同试验时间斑马鱼死亡情况（%）

2.2 半致死浓度（LC50）

斑马鱼急性毒性试验96 h 的LC50值以及95%的置信限由统计软件SPSS 20计算而得。计算得代谢物半致死浓度LC50为1.606 mg/l，95%置信区间为1.207～2.199 mg/l（见表2），参照国家环保局制订的《生物技术监测规范（水环境部分）》中对毒物的分类（见表3），代谢物对斑马鱼的毒性属于中毒[13]。对照组中斑马鱼的死亡率为0。

表2 短小芽孢杆菌代谢物对斑马鱼96 h的半致死浓度

表3 毒物对鱼类的毒性标准

2.3 短小芽孢杆菌抗菌代谢物对斑马鱼不同组织相关酶活力的影响

2.3.1 短小芽孢杆菌抗菌代谢物对斑马鱼躯干组织丙二醛（MDA）含量的影响

利用硫代苯巴比妥法（TBA 法）测得各浓度组代谢物中躯干MDA含量如图1所示。与对照组相比，短小芽孢杆菌代谢物浓度在低于0.9 mg/l 的情况下，对MDA 的含量没有显著的影响。但是，当短小芽孢杆菌代谢物浓度达到1.5 mg/l浓度以上时，MDA的含量显著性增加。

丙二醛(MDA)是膜脂过氧化最重要的产物之一，生物机体在受到外界不良因素刺激时，会通过酶或非酶系统产生自由基，自由基会攻击生物膜产生丙二醛等脂质过氧化物，丙二醛含量间接反映了机体受到损伤的程度。它的产生会加剧膜的损伤，因此可通过检测MDA 的含量来了解膜脂过氧化的程度[14]。图1 结果表明短小芽孢杆菌代谢物浓度达到1.5 mg/l 时，机体内MDA 积累量出现显著性增加。当代谢物浓度在0.3、0.6、0.9 mg/l 时，均未对MDA 的含量产生影响。所以，我们得出短小芽孢杆菌代谢物超过一定浓度时会对机体造成损伤。

图1 斑马鱼96 h躯干MDA含量的影响

2.3.2 短小芽孢杆菌抗菌代谢物对斑马鱼躯干组织超氧化物歧化酶（SOD）酶活力的影响

利用SOD 试剂盒（WST-1 法）测各浓度组躯干总SOD酶活力如图2。

图2 斑马鱼96 h躯干SOD酶活力的影响

机体在外界环境变化时会产生应激反应，产生超氧阴离子自由基(O2-·)[15]，SOD是生物体内重要的抗氧化酶，是一类敏感的分子生态毒理学指标，它可催化超氧阴离子与氮离子反应生成过氧化氨，从而解除活性氧对机体的损伤作用，当环境胁迫达到一定程度时生物体内SOD活性通常会降低，从而导致活性氧产生细胞毒性，及脂质过氧化，损伤细胞膜，引起炎症，肿瘤和自身免疫性疾病，并可能促使机体衰老；由图2可知，在一定浓度范围内，随着代谢物浓度（0.3、0.6、0.9 mg/l）的增加，SOD的酶活力呈增加趋势（P＞0.05），可以清除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质，对机体具有一定的保护作用；但当代谢物浓度达到1.5 mg/l以上时，与对照组相比，SOD的酶活力显著或极显著降低（P＜0.05 或P＜0.01），机体修复能力下降。因此，当代谢物浓度达到一定时，造成机体损伤，从而产生鱼体死亡。

2.3.3 短小芽孢杆菌抗菌代谢物对斑马鱼头部组织乙酰胆碱酯酶AchE酶活力的影响

利用乙酰胆碱酯酶试剂盒测试各浓度组头部AchE酶活力如图3所示。

图3 斑马鱼96 h头部AchE酶活力的影响

由图3 可知，代谢物在低浓度时，AchE 酶活力呈增加趋势（P＞0.05），但随着代谢物浓度的升高，AchE 酶 活 力 显 著 或 极 显 著 降 低（P＜0.05 或P＜0.01）。乙酰胆碱酯酶可参与神经调节、肌肉运动、大脑思维记忆等功能[16]，测试斑马鱼头部乙酰胆碱酯酶活力，可以评价该代谢物的神经毒性。图3 表明随着药剂浓度增大，抑制乙酰胆碱酯酶活力的能力随之增加，机体受损程度随浓度加大而加重。这干扰了斑马鱼体内乙酰胆碱酯酶的作用，从而表现出试验中的S 型扭曲游动，游速加快，并出现撞壁现象等神经中毒现象。由于肝脏是合成AchE 的唯一器官，这与解剖中看到的肝脏受损严重是一致的。

2.4 短小芽孢杆菌抗菌活性物质对斑马鱼头部组织Na+K+-ATPase酶活力的影响

利用Na+K+-ATPase 试剂盒测试各浓度组头部Na+K+-ATPase酶活力见图4。

图4 结果显示，0.3、0.6、0.9 mg/l 的代谢物浓度对Na+K+-ATPase 的酶活力无显著影响（P＞0.05）。但随着代谢物浓度增加（1.5、3、6 mg/l），Na+K+-ATPase 的酶活力极显著增加（P＜0.01）。Na+K+-ATPase 是存在于组织细胞及细胞器的膜上的一种蛋白，在物质运送、能量转换及信息传递方面具有重要的作用，鱼类的氯细胞主要分布于腮丝上皮内，氯细胞中含有大量的线粒体，而膜上有丰富的Na+K+-ATPase，这是细胞内外离子转运的结构。代谢物达到一定浓度时，对机体产生生理毒性（如图1），使SOD 的酶活力降低（如图2），从而造成氧化损伤，导致生物膜的脂质过氧化（如图3），生物膜损伤会导致细胞渗透压的紊乱，因此Na+K+-ATPase 酶活力增加来维持细胞的内环境稳态（如图4）。

图4 斑马鱼96 h头部Na+K+-ATPase酶活力的影响

3 讨论

根据本试验结果，斑马鱼在短小芽孢杆菌抗菌代谢物浓度为0、0.3、0.6、0.9、1.5、3、6 mg/l 条件下，96 h 死亡率依次为0%、0%、0%、0%、62.5%、87.5%、100%。从表1 可以看出，在96 h 内，在一定的浓度范围内，抗菌代谢物对机体并没有造成损伤，这与抗菌代谢物在环境中对致病菌具有一定抑制作用，从而间接的净化鱼体肠道健康，增加鱼体抵抗力，维持正常代谢与生命活动。这从图2、图3 的结果中可以看到。但随着时间及浓度的增加，抗菌代谢物对斑马鱼的毒性作用开始明显，并有明显的时间效应、浓度效应关系，这是因为代谢物浓度过高，不但对致病菌产生抑制作用，并且对一般环境及鱼体肠道内的正常菌群也起到一定抑制作用，从而破坏了肠道整体菌群失衡，造成抵抗力下降，机体内各种生物酶活力受代谢物影响，MDA 含量、Na+K+-ATP 酶活力上升，SOD、乙酰胆碱酯酶活力下降，说明机体应激反应以自我保护的能力下降，不足以维持自身正常稳态而受到不同程度的损伤。神经系统、脑组织、肌肉组织等许多器官功能发生改变，甚至受损，从而影响改变了斑马鱼的行为变化，导致鱼呼吸急促、运动机能减弱，最终导致窒息死亡[17]。