单一中草药以及复方中草药体外抑菌效果研究

■李美发 陈作栋 梁 欢 柏 峻 赵二龙 易中华 瞿明仁 许兰娇

（江西农业大学 江西省动物营养重点实验室饲料工程研究中心，江西南昌330045）

中草药因其绿色、安全、低残留、不易产生抗药性等优势，是一种前途远大的绿色饲料添加剂[1-2]。

从近些年的研究发现，关于中草药的体外抑菌试验的报道有很多[3-5]。吕彪等[6]采用水煎煮法，对大黄、黄连和黄岑等20种中草药的抑菌活性进行分析，采用试管二倍稀释法，测定中草药对猪链球菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)，结果显示，大黄、黄连对四种病原菌有良好的抑菌作用。向双云等[7]，采用平板打孔法、牛津杯法和试管二倍稀释法，检测8种中草药对大肠杆菌的抑制作用，结果表明：黄连、鱼腥草、五味子、艾草对大肠杆菌的抑菌效果为高度敏感，五味子和艾草的最小抑菌浓度(MIC)为62.5 mg/ml，黄连和鱼腥草的最小抑菌浓度(MIC)为125 mg/ml，大肠杆菌对其他4种中草药均不敏感。中草药的种类繁多，有效成分复杂，不同中草药与不同菌种间的抑菌效果也存在很大差异。本研究旨在研究单一中草药抑菌效果的基础上，探讨不同的中草药组方对育肥猪大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抑菌效果，为猪用复方添加剂生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄芪等八种中草药购买于药材市场。多种中草药的复配组合以及黄芪、黄连、大黄的复配比例根据本实验室前期研究确定。供试细菌为猪大肠杆菌、猪沙门氏菌、猪金黄色葡萄球菌，由江西农业大学动物科学技术学院预防兽医学实验室提供。

普通肉汤培养基：牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，加纯化水至1 000 ml，pH值为7.2～7.4。

普通营养琼脂培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，琼脂20 g，加纯化水1 000 ml，pH值为7.2～7.4。

1.2 药物制备

分别称取中草药10 g，按1∶10 比例加入100 ml蒸馏水，浸提24 h。浸提后转移到超声波震荡器中，超声20 min，使药物中的有效成分充分溶解。再用文火加热煮沸10 min，过滤后对药渣进行二次提取，合并两次提取的药液放入60 ℃的水浴锅中浓缩。过滤、离心沉淀，最后浓缩至含生药1 g/ml。

1.3 菌液培养

试验前将大肠杆菌和沙门氏菌菌种接到普通肉汤培养基中复活，将复活的供试菌接种于普通营养琼脂培养基上，37 ℃培养24 h，挑取典型菌落，接种于普通肉汤培养基，用灭菌生理盐水稀释，使其浊度达到1×105～1×109cfu/ml。

1.4 双层琼脂扩散法

培养皿底层为15 ml 琼脂培养基，待底层培养基凝固后，将10 μl金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的培养液分别与10 ml灭菌后在55 ℃的半固体琼脂培养基混合均匀后，倒入铺有下层培养基的平板上，待培养基凝固后放入牛津杯，每个牛津杯加入280 μl药物试剂，37 ℃培养24 h，测定抑菌圈直径。抑菌圈直径＞20 mm 为高度敏感，＞15 mm 且≤20 mm 为中度敏感，＞10 mm且≤15 mm为低度敏感，≤10 mm为不敏感。

1.5 微量二倍稀释法

将两种中草药提取液用二倍稀释法配成系列浓度的供试药液。浓度梯度为1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.82、3.91、1.96 mg/ml。在试管中加入20 ml 菌液和20 ml 药液，以无菌水作为对照，37 ℃培养24 h。观察各管细菌生长情况，其中浑浊带有沉淀，说明有细菌生长，澄清透明说明该试管在相应药物浓度下对细菌生长有抑制作用。能抑制细菌生长的最低药物浓度即为最小抑菌浓度。

1.6 复方中草药的体外抑菌效果

单味中草药所含的活性物质较为单一，有很大的局限性，用它来预防和治疗复杂的疾病，疗效较差。中草药复方的活性成分多，将多种中草药合理地搭配起来，形成一个新的整体，发挥最大的功效。当然，中草药复方的成分较复杂，活性物质难以分析，药理作用研究难度大。在单一的中草药体外抑菌试验基础上，为进一步研究复方中草药的体外抑菌效果，采用黄芪∶何首乌按照1∶1、1∶3、3∶1；黄芪∶黄连∶大黄按照1∶1∶2、1∶2∶1、2∶1∶1 的比例进行复配。通过体外抑菌实验，研究中草药组方对育肥猪肠道有害菌群的影响。

1.7 统计与分析

采用Excel 2003进行数据的整理。

2 结果

2.1 八种中草药对育肥猪肠道菌群药敏效果的影响（见表1）

由表1 可知，中草药浓度为1 g/ml 时，黄连、金银花和五倍子对大肠杆菌呈高度敏感，抑菌圈直径分别为24.54、20.13、20.13 mm，黄芪、大黄和白头翁呈中度敏感，抑菌圈直径分别为19.23、19.93、18.97 mm。首乌和葛根呈低度敏感，抑菌圈直径均为10.7 mm。黄芪、黄连和大黄对金黄色葡萄球菌呈低度敏感，抑菌圈直径分别为14.07、12.57、14.4 mm，其他中草药无敏感性。黄连和大黄对沙门氏菌呈中度敏感，抑菌圈直径分别为17.17 mm和18.13 mm，黄芪呈低度敏感，抑菌圈直径为10.37 mm，其他中草药无敏感性。

2.2 八种中草药对育肥猪肠道菌群最小抑菌浓度的影响

2.2.1 八种中草药对育肥猪大肠杆菌最小抑菌浓度的影响（见表2）

表2 八种中草药对大肠杆菌最小抑菌浓度

由表2 可知，各中草药对大肠杆菌均有一定的抑制效果，其中黄连和大黄效果最好，抑菌效果最强，MIC 值均为31.25 mg/ml，其次为首乌、金银花、白头翁和五倍子，MIC 值均为125 mg/ml，抑菌效果良好。黄芪和葛根，MIC值均为250 mg/ml，抑菌效果较差

2.2.2 八种中草药对育肥猪金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度的影响（见表3）

表3 八种中草药对金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度

由表3可知，各中草药对金黄色葡萄球菌抑制效果最好的是黄连和大黄，MIC 值均为125 mg/ml，其次为黄芪，MIC 值为250 mg/ml，抑菌效果一般。其他中草药，抑菌效果较差。

2.2.3 八种中草药对育肥猪沙门氏菌最小抑菌浓度的影响（见表4）

表4 八种中草药对沙门氏菌最小抑菌浓度

由表4 可知，沙门氏菌对黄连和大黄抑制效果最好，MIC 值均为62.5 mg/ml，其次为黄芪，MIC 值为250 mg/ml，抑菌效果一般。其他中草药，抑菌效果较差。

2.3 两种中草药对育肥猪肠道菌群药敏效果的影响（见表5）

表5 黄芪和何首乌复配体外抑菌效果

由表5 可知，黄芪和何首乌混合试验，黄芪0.75 mg/ml+何首乌0.25 mg/ml 效果最好，大肠杆菌抑菌圈直径16.1 mm，呈中度敏感，金黄色葡萄球菌抑菌圈直径11 mm，呈低度敏感，沙门氏菌抑菌圈直径9.8 mm，呈不敏感。黄芪0.25 mg/ml+何首乌0.75 mg/ml 和黄芪0.50 mg/ml+何首乌0.50 mg/ml，对大肠杆菌呈低度敏感，对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌均为不敏感。

2.4 三种中草药对育肥猪肠道菌群药敏效果的影响（见表6）

表6 黄芪、黄连和大黄复配体外抑菌效果

由表6可知，黄芪、黄连和大黄三种混合试验，黄芪0.25 mg/ml+黄连0.5 mg/ml+大黄0.25 mg/ml 效果最好，大肠杆菌抑菌圈直径15.4 mm，呈中度敏感，金黄色葡萄球菌抑菌圈直径12.9 mm，呈低度敏感，沙门氏菌抑菌圈直径12.8 mm，呈低度敏感。其他两组药剂对三种菌都呈低度敏感，抑菌效果一般。

3 讨论

3.1 综合八种中草药对育肥猪大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌效果，黄芪、黄连和大黄三种中草药效果最好，对三种菌群均有明显抑制作用。本试验中，大黄对大肠杆菌有中度抑制作用，与张赛奇等研究结果[8]一致，但岳云升等发现大黄对大肠杆菌几乎无作用[9]。何首乌对金黄色葡萄球菌没有抑制效果，与汪倩雯等[10]报道一致。不同研究人员对同一种中草药的研究结果差异很大。陈希文等研究发现何首乌有中度抑制作用[11]，杨闻等将何首乌破碎，乙醇回流提取，超声波辅助，其最终产物具有明显抑菌功效[12]。黄芪对沙门氏菌有较弱的抑制作用，与李国旺等研究发现[13]相同，王宁等研究表明黄芪对常见的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌有明显的抑制作用[14]。中草药的抗菌成分主要为黄酮、生物碱、挥发油等，中草药体外抑菌能力与提取物成分和含量有关，其有效成分能破坏病原菌细胞壁和细胞膜，影响细菌的代谢，同时也给机体提供营养，增强免疫器官机能。中草药中的活性成分还可以减弱5-羟色胺和组胺的血管通透性，抑制细胞排出，从侧面起到抑菌作用[15]。还有研究表明，中草药中的活性成分能消除R质粒[16]，抑制β-内酰胺[17]，起到影响病原菌的耐药性的作用。本试验中抑菌圈的大小与相关研究存在一定差异，原因可能是中草药的产地、提取工艺、菌种血清型不同和测定方法不同。

3.2 利用中草药组方可以减轻毒副作用，增强药效，应用效果更好的优点[18]。研究了2种组方对育肥猪3种肠道有害菌的体外抑菌效果，以黄芪、黄连和大黄的组方效果最好，黄连比例越高，抑菌效果越好。2个组方对3种有害菌都有一定的抑菌作用，但是效果没有单一中草药的效果好。主要原因是各单一中草药抑菌效果存在差异，在体外抑菌试验中，单一中草药的单位体积有效成分多于在组方中的含量，混合后抑菌成分有所下降。用双层琼脂扩散法时，组方中草药的成分较单一中草药复杂，相互作用会影响药液在琼脂上的扩散，从而影响其在平板上的抑菌效果[19]，所以单一中草药的抑菌效果比组方好。

4 结论

在本试验条件下：①黄连、金银花和五倍子对大肠杆菌抑菌效果较好。②黄芪、黄连和大黄对金黄色葡萄球菌抑菌效果较好。③黄连和大黄对沙门氏菌抑菌效果较好。④中草药组方以黄芪0.25 mg/ml+黄连0.5 mg/ml+大黄0.25 mg/ml体外抑菌效果最好。同时通过本试验，结合国内，尤其是金银花、黄连等中草药的产量，以及中草药的绿色、安全等多种优势，黄连、金银花等中草药在现在以及未来的替抗、保障动物健康以及动物食品的安全方面，会发挥越来越重要的作用。随着技术的进步，中草药提取物的制备工艺日渐成熟，中草药的应用会更有针对性，金银花、黄连等中草药在动物生产中的应用越来越广泛，从而降低饲养成本，进一步提高经济效益。