氨基酸纸层析展层溶剂初探

杨继业 ，高 佳 ，陈书明 ，刘 慈 ，张 林 ，姬翔宇 ，王 宁 ，卫 阳 ，武怡荷

（1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801；2.山西省畜牧遗传育种中心，山西太原030027）

纸层析是典型的分配层析，具有操作简单、所需样品量少、分辨率一般能达到要求等优点，是氨基酸等生物小分子分离、鉴定常用的方法[1-3]。纸层析用滤纸作为支持物，以滤纸纤维的结合水为固定相，沿滤纸流动的有机溶剂为流动相，根据混合样品中各组分在两相中分配系数的不同，从而达到混合样品中各组分快速、高效分离的目的[4-6]。如果将定量的各氨基酸样品点在滤纸上，当流动相沿滤纸经过样品时，样品点上的氨基酸在水和有机相之间不断进行分配。随着流动相的移动，各种氨基酸按其各自的分配系数不断得到分配，从而使各种氨基酸得到分离[7-10]。应用纸层析法分离鉴定氨基酸是生物化学分析中常用的方法，也是生命科学、畜牧和兽医等相关专业本科生教学大纲要求的必修实验之一。

在科研过程中或本科生开展纸层析法分离鉴定氨基酸实验过程中，由于班级及人数较多，实验室空间有限，所以必须分组，各组在不同时间段完成实验。在此过程中，发现靠后做实验的小组出现氨基酸层析斑点扩散、分离效果差及Rf值减小等问题。究其原因可能是由于多次重复实验过程中，层析溶剂（又称展层溶剂）中部分有机溶剂挥发，使层析溶剂中有机溶剂与水的比例发生改变[11-14]，从而导致层析效果不理想。以往我们将使用5 d（或重复使用5次）后的层析溶剂倒掉，重新配制新溶剂。但这会引起实验成本升高与环境污染问题。

本试验在重复使用5次后的层析溶剂中，分别续加不同体积的正丁醇与80%甲酸混合液（体积比5∶1），然后与新配制的层析溶剂进行氨基酸纸层析对比试验，以期解决层析溶剂多次重复使用后实验效果差的问题。

1 材料和方法

1.1 材料

标准氨基酸溶液：称取赖氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸和谷氨酸标准品各10 mg溶于10 mL 0.01 mol/L的HCl中，配成质量浓度为1 mg/mL的标准氨基酸溶液[15]。

混合氨基酸溶液：将上述4种标准氨基酸溶液等浓度混合，使各标准氨基酸质量浓度达1mg/mL[15]。

展层溶剂：按正丁醇∶80%甲酸∶水=15∶3∶2（体积比）的比例配制300 mL，分别放入3个层析缸中，每个层析缸100 mL，并标记为1号液、2号液和3号液。在学生重复使用5次后，待第6次实验前，按照正丁醇∶80%甲酸＝5∶1（体积比）的比例配制混合液，取该混合液0，6，12 mL分别添加在上述1号液、2号液和3号液中；同时，按照正丁醇∶80%甲酸∶水＝15∶3∶2（体积比）再配制100 mL新层析溶剂放入另一层析缸内，标记为对照组，然后进行氨基酸纸层析对比试验。

显色剂：0.5%茚三酮乙醇溶液。

1.2 方法

1.2.1 层析滤纸的准备 裁剪层析滤纸（18 cm×18 cm）12张，在滤纸顶部分别标记对照组、1号液、2号液、3号液（每组设置3个重复），并在距滤纸下边缘2cm处用铅笔轻轻划一条线，在线上每隔3cm画一小圆点作为点氨基酸样品的标记[16]。

1.2.2 点样 将准备好的滤纸悬挂在点样架上，滤纸垂直桌面，用洁净毛细管（或裁剪了尖头的牙签）蘸取氨基酸样品，与滤纸垂直方向轻轻碰触点样标记点中心，使氨基酸样品吸附在滤纸上，点样点扩散直径控制约2 mm，自然晾干（或冷风吹干），再重复点第2次样品，如此重复点样3次[17-18]。对裁剪好的12张层析滤纸均用相同的方法进行点样，点样量以每种氨基酸含5～20 μg为宜，第3次点样后，自然晾干（或冷风吹干），再进行层析。

1.2.3 层析 在点好氨基酸样品的滤纸顶端两侧，用2个拉有线绳的曲别针夹住，用双手捏住线绳，将滤纸垂直放入标记好的层析缸中（特别注意层析溶剂不能淹没点样线，滤纸上的溶剂浸湿线要与滤纸上的点样线平行），盖紧层析缸，进行层析。当层析溶剂到达滤纸另一端的曲别针处时，取出层析滤纸，用吹风机热风吹干，用铅笔标出溶剂前沿线，然后进行氨基酸显色。

1.2.4 显色 用显色剂将层析滤纸溶剂前沿线下方区域喷湿，再用热风吹干，层析滤纸上即显示出蓝紫色斑点，然后测定各个氨基酸的比移值（Rf）[19]。

1.3 数据处理

采用SPSS 21.0对试验数据进行单因素方差分析和Duncan多重比较，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

4种标准氨基酸和混合氨基酸溶液的纸层析结果如图1所示。在图1中，混合氨基酸溶液分离出4 个斑点，分别为 AA1、AA2、AA3 和 AA4，点样线上“赖”表示赖氨酸，“苯丙”表示苯丙氨酸，“丙”表示丙氨酸，“谷”表示谷氨酸。

由图1可知，对照组中混合氨基酸的4个色斑均清晰可见，无明显偏离以及拖尾现象，表明分离效果良好，符合试验预期；而1号液组和2号液组中混合氨基酸色斑不清晰，且AA2和AA3有重叠现象，分离效果较差；3号液组中混合氨基酸的4个色斑较清晰，分离效果较好。

根据图1的纸层析结果，可测量并计算出各氨基酸的Rf值，其结果列于表1。由表1可知，4种标准氨基酸中除苯丙氨酸外，其余3种氨基酸在1号液组和2号液组的Rf值均显著低于对照组和3号液组（P＜0.05）；但对照组与3号液组相同氨基酸的Rf值差异均不显著（P＞0.05）。此外，对照组和3号液组中混合氨基酸的Rf值均与4种标准氨基酸Rf值差异不显著（P＞0.05），表明混合氨基酸AA1为苯丙氨酸；AA2为丙氨酸；AA3为谷氨酸和AA4为赖氨酸。

上述试验结果表明，在重复使用5次后的层析溶剂中补加正丁醇与80%甲酸（体积比为5∶1）混合液12 mL，再进行氨基酸纸层析试验，对混合氨基酸分离效果良好，与新配制层析溶剂所得试验结果差异不显著。

表1 4种氨基酸和混合氨基酸溶液的Rf值

3 结论与讨论

层析技术是一种根据混合物中各组分理化性质的差异，使混合物得以分离的技术，被广泛应用于农业、医药和生物科学等领域。依据原理不同，层析技术种类又可分为吸附层析、分配层析、分子筛层析、离子交换层析和亲和层析等[8]。其中，纸层析法属于分配层析，主要用于各种单糖、维生素和氨基酸等小分子化合物的分离鉴定。

在一定试验条件下，每种氨基酸纸层析都有其固定的Rf值，Rf值是被分离氨基酸的特征性常数[20]。但随着试验条件的改变，氨基酸的Rf值也会发生改变。刘颖沙等[21]对纸层析法分离鉴定氨基酸试验的层析溶剂进行了优化，结果认为，正丁醇、80%甲酸和水的体积比为15∶3∶2时，试验效果最好。山西农业大学动物科学、动物医学等很多本科专业都开设“纸层析法分离鉴定氨基酸”实验，由于班级数以及实验分组数很多，常会重复使用展层溶剂。而展层溶剂主要成分为正丁醇、甲酸和水，由于这3种成分沸点不同，挥发性能存在差异，所以长时间多次重复使用后，必然导致其中有机溶剂挥发较多，使展层溶剂中3种成分的比例发生改变，从而导致氨基酸Rf值发生改变，实验效果变差。本研究根据氨基酸纸层析实验原理及实验现象，在重复使用多次的层析溶剂中加入不同体积正丁醇与80%甲酸（体积比5∶1）混合液，混匀，然后与新配制的层析溶剂进行氨基酸纸层析对比试验，结果表明，在100 mL重复使用5次的层析溶剂中加入正丁醇与80%甲酸混合液12 mL，其试验效果与用新配制层析溶剂所得试验效果一致。结果表明，重复使用多次的层析溶剂可以不废弃，只需添加一定量正丁醇与80%甲酸混合液即可继续使用。这样不仅节约了实验成本，而且减少了实验废液的排放，既经济又环保。

氨基酸纸层析Rf值除了与氨基酸自身结构紧密相关外，还与展层溶剂等多因素有关。有研究表明[21]，氨基酸层析分离采用薄层板比采用滤纸分离效果更好。在纸层析法分离鉴定氨基酸实验中，还应注意几点：试验过程中应保持层析滤纸干净，尽量避免用手直接触摸，带一次性PE手套操作为好；点样线（点）应该用铅笔画，不能用油笔及中性笔，因为展层溶剂是含极性与非极性溶剂的两相系统，能溶解油笔及中性笔的标记；点样斑点直径以2 mm为宜，若点样斑点过大，会造成层析斑点因扩散更大并彼此连在一起，而使氨基酸难以分离，点样斑点小，点样量少，达不到氨基酸显示的灵敏度（可以用吹风机冷风将点样斑点吹干后，再重复点样2次，这样既可以保障点样斑点小，又能保障氨基酸显色需要的点样量）；点样过程中，不能用吹风机的热风吹，防止因温度过高导致氨基酸与滤纸纤维紧密连接，造成氨基酸层析斑点拖尾而难以分离；展层时，应注意展层溶剂不能淹没点样线，否则样品会溶于展层溶剂中，造成实验失败，另外，层析滤纸要垂直，一个层析缸放多张层析滤纸时，不能相互靠在一起，否则相互影响，也会造成实验失败。