白细胞介素-6受体、白细胞介素-27基因多态性与冠心病易感性的相关性研究

冠心病是导致人类死亡最常见的原因之一。WHO报告显示，冠心病死亡率占全球总死亡率的12.9%[1]。随着人民生活水平的提高与老龄化进程的加快，中国冠心病的发病率、死亡率逐年上升[2]。研究表明，免疫炎症反应在冠心病的发生发展过程中发挥着重要作用。白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)是细胞中重要的促炎因子，IL-6与其受体(IL-6R)结合后，可诱导多种细胞分化、成熟及凋亡[3-4]。白细胞介素-27(interleukin-27，IL-27)是由p28亚基与EB病毒诱导基因3(Epstein Barrvirus induced gene 3，EBI3)亚基结合形成的异源二聚体，具有促炎和抗炎双向调节作用。研究发现，IL-6、IL-27基因多态性与炎症、免疫、肿瘤、病毒感染等疾病密切相关[5-6]。但目前关于IL-6R、IL-27基因多态性与冠心病关联分析的研究还较少。本研究通过检测冠心病病人IL-6R、IL-27基因型，分析其与冠心病易感性的关系，从遗传学角度探究冠心病的发病因素。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择本院心血管内科2015年6月—2017年8月收治的冠心病病人226例为试验组，其中男163例，女63例；年龄37～86(60.42±17.83)岁。全部病例符合1979年WHO公布的冠心病诊断标准[7]。采用Judkins法[8]进行冠状动脉造影，冠状动脉主要分支狭窄程度≥50%确诊为冠心病。所选病例均排除肿瘤、脑血管疾病、血液系统疾病、急慢性感染、严重肝肾疾病、全身免疫性疾病等。另选择同期于本院体检且年龄等相仿的200名身体健康者作为对照组，年龄40～80(62.74±18.39)岁；男150名，女50名。两组受试者的性别、年龄等临床资料差异无统计学意义(P>0.05)。所有受试者均签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会审核批准。

1.2 临床资料 收集所有受试者身高、体重、血压、血浆总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，凝血四项指标包括凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(FIB)等。

1.3 主要试剂 Platinum Taq DNA聚合酶购自南京金思特科技公司；IL-6R和IL-27引物购自上海生工公司；人外周血基因组DNA提取试剂盒购自中国康为世纪生物公司；ABI9700型PCR扩增仪购自美国Applied Biosystem公司；紫外分光光度计购自美国Bio-Rad公司；琼脂糖凝胶电泳仪购自北京六一仪器厂。

1.4 基因组DNA的提取 全部受试者均空腹采集6 mL肘静脉血液，用EDTA-Na进行抗凝处理。采用DNA提取试剂盒提取各受试者的全血基因组DNA，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。紫外分光光度计检测DNA纯度及浓度，OD260/280为1.8～2.0，可用于后续试验。将DNA稀释至20 ng/μL后分装，保存于-20 ℃冰箱备用。

1.5 IL-6R和IL-27基因多态性的检测 使用HapMap数据库和Haploview软件选择IL-6R和IL-27的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点，最终6个SNP位点被研究。采用高分辨率溶解曲线(PCR-HRM)技术对IL-6R和IL-27基因进行分型，引物序列见表1。PCR-HRM反应体系的配制：10×Buffer 2.0 μL、10 mmol/L dNTPs 0.4 μL、20 μmol/L上下游引物各0.5 μL、DNA 2.0 μL、Platinum Taq DNA聚合酶0.16 μL，最后加ddH2O至20 μL；反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性25 s，62 ℃退火延伸40 s，10个循环；95 ℃变性25 s，57 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，27个循环；72 ℃延伸2 min。HRM条件：96 ℃变性30 s，45 ℃退火30 s，对72～90 ℃的溶解曲线数据进行收集。根据溶解曲线峰型变化对IL-6R和IL-27基因进行分型。

表1 IL-6R和IL-27基因各SNPs引物序列

2 结 果

2.1 两组受试者基线资料比较 两组受试者年龄、性别、体质指数(BMI)、收缩压、舒张压等资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较，试验组血脂指标TG、LDL-C水平均显著升高(P<0.05)，而TC水平显著降低(P<0.05)。与对照组比较，试验组凝血指标PT显著延长、FIB升高(P<0.05)，而TT显著缩短(P<0.05)。详见表2。

表2 两组受试者基线资料比较(±s)

2.2 两组受试者血清IL-6R基因多态性分析 PCR-HRM结果证实，IL-6R(183A/G)检测到3种基因型：AA、AG、GG；IL-6R(exon1A/C)检测到3种基因型：AA、AC、CC；IL-6R(exon2A/T)检测到2种基因型：AT、TT。IL-6R基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡检验。IL-6R(183A/G)的基因型及等位基因频率在试验组和对照组间的差异无统计学意义(P>0.05)。IL-6R(exon1A/C)和IL-6R(exon2A/T)的基因型及等位基因频率在试验组和对照组间的差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 两组受试者血清IL-6R基因型及等位基因频率 例(%)

2.3 两组受试者血清IL-27基因多态性分析 PCR-HRM结果证实，IL-27(4730T/C)检测到2种基因型：TT、TC；IL-27(-964A/G)检测到3种基因型：AA、AG、GG；IL-27(2905T/G)检测到2种基因型：TT、TG。IL-27基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡检验。IL-27(4730T/C)、IL-27(-964A/G)和IL-27(2905T/G)的基因型及等位基因频率在试验组和对照组间的差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表4。

2.4 IL-6R和IL-27基因多态性与冠心病发生风险的关联分析 对基因型及基因频率在试验组和对照组间的差异有统计学意义的两个位点，即IL-6R(exon1A/C)、IL-6R(exon2A/T)，采用Logistic回归分析这两个位点的突变基因型与冠心病发生风险的相关性。以野生纯合型为基准，突变基因型为哑变量。IL-6R(exon1A/C)的突变杂合基因型AC与野生纯合型AA间的差异无统计学意义(P>0.05)，而突变纯合基因型CC与野生纯合型AA间的差异有统计学意义(P<0.05)，其突变基因型可降低冠心病的发病风险。IL-6R(exon2A/T)的突变杂合基因型AT与野生纯合型TT间的差异有统计学意义(P<0.05)，其突变基因型可增加冠心病的发病风险。详见表5。

表4 两组受试者血清IL-27基因型及等位基因频率 例(%)

表5 IL-6R和IL-27基因多态性与冠心病发生风险的Logistic回归分析

2.5 IL-6R和IL-27基因多态性与冠心病病人血清指标的关系 将IL-6R、IL-27基因多态性与冠心病病人血清指标检测结果进行统计分析发现，IL-6R(exon1A/C)的基因型与血脂指标TC、HDL-C显著相关(P<0.05)。详见表6。

表6 IL-6R和IL-27基因多态性与冠心病病人血清指标的关系

3 讨 论

冠心病是一种遗传和环境因素相互作用造成的复杂性疾病。有研究发现，家族遗传因素与冠心病的发生密切相关，那么发掘与冠心病相关的基因多态性，成为防治冠心病的关键[9]。动脉粥样硬化是冠心病发生的主要危险因素，而动脉粥样硬化是由血管管壁慢性炎症反应所致，细胞因子如白细胞介素、肿瘤坏死因子、C-反应蛋白等在该过程中发挥重要作用[10]。细胞因子的生成由基因所调控，基因多态性可能会影响细胞因子的表达[11]。因此，细胞因子多态性可能与疾病的发生有关。IL-6主要是由单核巨噬细胞、血管内皮细胞、Th2细胞等细胞合成分泌，在血液中广泛存在，介导各种免疫、炎症反应。IL-6的主要功能有促进活化B细胞分化成熟，促进T细胞活化增殖，促进肝细胞在急性炎症期合成炎性因子等。IL-6与其靶细胞表面的IL-6R特异性结合后，可激活gp130并与其结合成三元复合物，启动Janus家族酪氨酸激酶信号传导与转录活化因子(JAK/STAT3)途径和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径发挥作用[12-13]。大量研究证实，冠心病病人血清中的IL-6、IL-6R表达量显著高于正常对照组，表明IL-6、IL-6R可能参与冠心病的发病过程[14]。另有研究证实，血清IL-6含量可预测冠心病的发病风险，且与冠心病的病情进展、预后均有关[15]。由于IL-6、IL-6R表达量由基因所调控，因此分析IL-6、IL-6R基因多态性与冠心病易感性的关系可为该病的发病机制提供新线索。目前关于IL-6基因多态性的研究相对较多，但关于IL-6R基因多态性的研究还很少。本研究就IL-6R基因多态性与冠心病易感性的关系进行了研究，结果发现IL-6R(exon1A/C)和IL-6R(exon2A/T)在试验组和对照组间的差异均有统计学意义，IL-6R(exon1A/C)的突变纯合基因型CC可降低冠心病的发病风险，而IL-6R(exon2A/T)的突变杂合基因型AT可增加冠心病的发病风险，说明IL-6R基因多态性与冠心病易感性有关。IL-6R(exon1A/C)的基因型与血脂指标TC、HDL-C显著相关，说明IL-6R基因多态性与脂质代谢也有关。

IL-27是一种新型的IL6/IL12家族炎性因子，在炎症反应的不同阶段或不同刺激下发挥双向调控作用，一方面能促进初始CD4+T细胞分化成Th1型细胞，促进炎症反应的发生；另一方面又能抑制Th17细胞合成分泌IL-17，从而发挥抗炎作用[16]。IL-27在冠心病中的作用目前尚有争议。有研究发现，急性心力衰竭病人血清中IL-27水平显著高于正常对照组，故而认为IL-27可促进缺血性心脏病的发生[17]。另有研究发现，IL-27可通过抑制巨噬细胞的活性来减缓小鼠动脉粥样硬化的病情进展[18]。目前从遗传角度研究IL-27基因与冠心病关系的报道还很少。本研究就IL-27基因多态性与冠心病易感性的关系进行了研究，结果发现IL-27(4730T/C)检测到2种基因型：TT、TC；IL-27(-964A/G)检测到3种基因型：AA、AG、GG；IL-27(2905T/G)检测到2种基因型：TT、TG。但IL-27(4730T/C)、IL-27(-964A/G)和IL-27(2905T/G)的基因型及等位基因频率在试验组和对照组间的差异均无统计学意义，而且IL-27基因型与血脂指标(TC、TG、LDL-C、HDL-C)及凝血指标(PT、APTT、TT、FIB)均无关，说明IL-27基因多态性与冠心病易感性、脂质代谢均无关。

本研究结果初步表明，血清IL-6R(exon1A/C)、IL-6R(exon2A/T)多态性与冠心病易感性有关，且IL-6R(exon1A/C)的基因型与血脂指标TC、HDL-C显著相关，而IL-27基因多态性与冠心病易感性无关。IL-6R基因多态性与冠心病易感性及脂质代谢的相关性，可能为冠心病的发生机制提供一定的参考价值。