电针足三里对坐骨神经慢性压迫性损伤大鼠脊髓背角ERK1／2蛋白表达的影响

李瑜芝 ，余文英 ，吴倩雯 ，黄 华 ，林丽莉

（1.福建中医药大学针灸学院，福建 福州 350122；2.澳大利亚悉尼北京同仁堂中医诊所，澳大利亚 悉尼 2000）

神经病理性疼痛是躯体感觉系统损害或疾病导致的疼痛，主要临床表现为自发痛，不同患者疼痛性质不全相同，以牵扯样痛、电击样痛、针刺样痛、撕裂样痛、烧灼样痛、重压性痛、膨胀样痛及麻木样痛较多见，发病机制主要在于外周敏化、中枢敏化及离子通道改变［1］。细胞外信号调节蛋白激酶（ERK1／2）为丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）的重要家族成员之一［2］，其参与多种细胞信号传导，在疼痛性伤害性刺激引起的外周及中枢神经递质、细胞信号传导、离子通道等变化中发挥重要作用。研究已经表明在多种疼痛模型中脊髓背角磷酸化ERK1／2被激活，表达显著升高，提示活化的ERK1／2可能参与疼痛的维持和痛觉的神经敏化［3-5］。针刺镇痛历史悠久，疗效显著，电针是在传统针刺的基础上加入一定参数的电流进行脉冲刺激以增强疗效的现代疗法，其镇痛作用明确［6］。针刺足三里具有良好的镇痛效果，尤其体现在神经病理性疼痛、炎性痛和癌症痛等［7-8］。本研究旨在通过观察电针足三里穴对慢性神经病理性疼痛大鼠脊髓背角ERK1／2蛋白表达的影响，探讨电针足三里穴镇痛可能的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠24只，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2012-0002，体质量 220～280 g，由福建中医药大学实验动物中心饲养，自由进食饮水，室温保持在（25±2）℃，光照周期 12／12 h。

1.2 实验试剂与仪器 双极针灸针（0.30 mm×25 mm，苏州针灸用品有限公司）；HANS-200A韩氏穴位神经刺激仪（北京华运安特科技有限责任公司）；4-0络制肠线（上海浦东金环医疗用品股份有限公司）；ERK1／2一抗（武汉三鹰生物技术有限公司）；β-action一抗（美国 CST 公司）；HRP 鼠抗兔IgG二抗（南京诺维赞生物科技有限公司）。

2 实验方法

2.1 热痛阈值测定 将大鼠置于黑色布袋中，头部在前，待测尾部露出布袋外，待动物安静后进行热痛阈值测量。在布套束缚限制运动的条件下，用50℃的热水浸烫大鼠尾部中下三分之一，以其甩尾时间阈值作为测痛指标，用秒表计时。每只测试3次，每次间隔5 min，取3次平均值，测试时间为上午8～12时。所有实验大鼠在入组前均接受热痛阈测定，热痛阈值小于2 s或者大于10 s者表示动物反应过敏或者迟钝，为痛觉异常大鼠，不纳入试验对象。

2.2 分组与造模 适应性喂养1周后进行热痛阈筛选，采用随机数表法将SD大鼠分为空白组、模型组、电针后即刻组、电针后0.5 h组，每组各6只。模型组、电针后即刻组和电针后0.5 h组参照文献［9］中的造模方法：手术前一天禁食不禁水，用10%水合氯醛（4 mL／kg）腹腔注射，麻醉成功后，备皮、消毒、铺无菌巾，剪开术区皮肤约2 cm，钝性分离肌肉，暴露右侧坐骨神经中段，用4-0的铬制肠线给予疏松单结结扎4次，1 mm间隔，松紧度以不影响坐骨神经血液循环和右后肢肌肉出现轻微抖动为标准，结扎线可以在坐骨神经主干上滑动，在切口处敷青霉素钠盐粉预防感染，缝合皮肤。手术后，每3只大鼠为一笼饲养，麻醉清醒后自由摄取水和食物，密切观察生命体征和伤口愈合情况。

2.3 干预 将电针后即刻组和电针后30 min组大鼠固定于特制鼠笼中，使之头尾稍可活动，但身体不能转动，于造模后第7天开始进行双侧足三里穴电针治疗，参照《实验针灸学》［10］定位双侧足三里穴，约在大鼠腓骨小头下方约5 mm处，选用双极针配合韩式电针仪治疗，参数为：疏密波，2 Hz，输出电流1 mA。留针20 min，强度以大鼠肢体轻微颤动，但不出现挣扎为准。空白组和模型组大鼠固定于特制鼠笼，使之头尾稍可活动，但身体不能转动，固定20 min。

2.4 取材 空白组和模型组固定20 min后即刻取材，电针即刻组和电针后30 min组分别于电针后即刻和30 min后取材。以10%水合氯醛（4 mL／kg）腹腔麻醉，腹腔面朝上固定，打开胸腔，暴露心脏。灌注用针头自左心室插入主动脉，固定针头，剪开右心耳。用吊泵快速注入0.9%NaCl溶液冲洗血管，剪开大鼠背部正中线皮肤，分离脊柱两侧肌肉，暴露出胸、腰、骶段脊柱，先游离坐骨神经至椎管处，再剪开椎板暴露脊髓，用玻璃分离针挑开脊膜，最后迅速将脊髓剪下，截取脊髓腰膨大（L4～L6节段脊髓），迅速丢入液氮中，待取材完毕后转移至-80℃冰箱备用。

2.5 观察指标及方法

2.5.1 热痛阈值 检测4组大鼠造模前后及干预后热痛阈值。

2.5.2 Western blot法检测ERK1／2蛋白的表达提取脊髓组织总蛋白后，采用BCA蛋白定量法定量，取30 μg蛋白为上样量进行SDS-PAGE电泳，将表达产物电转移至聚偏氟乙烯膜上。在Western封闭液中封闭1～2 h，经TBST缓冲液清洗后分别加入一抗 ERK（1∶7 000）、β-actin（1∶1 000）孵育，4 ℃摇床过夜。TBST缓冲液清洗后加入二抗，室温孵育1.5 h。TBST再次清洗，于超高灵敏度化学发光成像系统中成像显影，采用Bio-Rad图像分析软件对条带进行灰度值分析。

2.6 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行数据统计分析。计量资料符合正态分布以（x±s）表示，采用单因素方差分析检验。

3 结 果

3.1 4组大鼠热痛阈值比较 见表1。

表1 4组大鼠热痛阈值比较（x±s）s

3.2 4组大鼠脊髓背角ERK1／2蛋白表达比较见图1。

图1 4组大鼠脊髓背角ERK1／2蛋白表达比较

4 讨 论

脊髓背角是疼痛信息传递和整合的初级中枢，当外周神经受到卡压、损伤或者炎性物质刺激时，伤害性信号经神经节初步滤过后向上传至脊髓的背角感觉神经元，从而引起痛觉［11］。神经性病理性疼痛是难治疗的痛症，目前已有较多相关研究，但在临床上仍然相当棘手，镇痛药物的使用难免给患者带来抑郁、烦躁等不适。研究表明神经性病理性疼痛动物模型中脊髓背角ERK1／2的表达显著升高，ERK1／2活性的变化与CCI导致的痛觉过敏有关，这充分说明ERK1／2蛋白可能参与神经性病理性疼痛的发生与维持［12-14］。同时有学者通过提前给予疼痛大鼠髓内注射ERK1／2抑制剂，发现其疼痛可以大幅度地减轻［15］。本课题通过免疫印迹技术的测定也观察到CCI模型大鼠的ERK1／2蛋白表达较空白组显著升高。

《胜玉歌》云：“两膝无端肿如斗，膝眼三里艾当施。”《席弘赋》亦云：“脚痛膝肿针三里。”《灵枢·四时气》曰：“著痹不去，……率取其三里。”《针灸大成》中认为足三里能治疗腰腿痛。《通玄指要赋》中亦可见“三里却五劳之羸瘦；痹肾败，取足阳明之上”的表述，《马丹阳十二穴歌》云：“三里膝眼下，三寸两筋间。能通心腹胀，……腿肿膝腔酸。”足以证明古代已经明确足三里治疗腰腿疼痛的重要功效，且足三里穴深层为腓深神经，这些神经正是坐骨神经的分支部分。研究应用针刺合谷、三阴交和足三里观察产妇镇痛的效果，结果提示足三里穴可以很好发挥镇痛的功效。李思思等［16］通过观察电针“足三里”“阳陵泉”穴对坐骨神经慢性压迫性损伤大鼠脊髓背角酪氨酸激酶B受体的影响，认为电针足三里穴可能是通过减少大鼠脊髓中 TrkB受体的表达而产生镇痛作用。乔丽娜等［17］研究认为支配足三里穴传入纤维的胞体主要位于L3～S1，不仅说明了针刺具有神经阶段性的镇痛，也符合现代神经解剖学和生理学理论远节段取穴和传统针刺远端取穴的原则。大量现代研究表明，足三里穴具有镇痛功效，尤其是对神经病理性疼痛和炎性痛有良好的效果，电针足三里穴可以明显缓解神经病理性疼痛［18-20］。

针刺疗法是祖国医学的重要外治法之一，体表细胞受到针刺机械刺激后，可引起某些蛋白或酶类物质活性的改变而导致一些瞬时效应，激活和启动其血管和神经的相关功能，以达镇痛的目的。而电针疗法是在传统针刺疗法基础上配合相应参数的电流与脉冲的一种现代医学疗法，研究发现其镇痛机制十分复杂，其中在外周中枢脊髓的镇痛机制主要表现为抑制胶质细胞的活化［21］，抑制突触的可塑性［22］，调控脊髓 NOS 的功能［23］，抑制兴奋递质的释放［24］，调节抗炎因子和促炎因子以及P2X受体的表达［25-26］。有研究表明电针通过抑制ERK1／2蛋白的表达来缓解神经性病理性疼痛［27-28］，但是从不同针刺时间的角度研究电针对脊髓背角ERK1／2蛋白的表达情况以研究其电针镇痛效应尚未见明确的报道。

本研究结果显示，电针足三里0.5 h后可提高CCI大鼠热痛阈水平，同时下调脊髓背角ERK1／2蛋白的表达，提示电针后0.5 h组通过可能抑制CCI模型大鼠ERK1／2蛋白水平的表达从而达到镇痛作用。相反，电针后即刻组ERK1／2蛋白水平稍高于模型组，可能是由于刚刚电针完的大鼠处于一种应激的状态而诱发了ERK1／2的活化。今后可进一步延长电针干预后时间进一步跟踪ERK1／2的表达，以更加明确电针抑制ERK1／2蛋白水平发挥镇痛效应，甚至进一步探讨电针后效应的特点。

综上所述，CCI模型可致大鼠脊髓背角ERK1／2蛋白的活化，使其表达增加，经电针足三里穴0.5 h后可以降低脊髓背角ERK1／2蛋白的表达水平，从而发挥镇痛效应。