抵当汤减钩吻毒性的实验研究

林慧敏 ，王婉莹 ，王文义 ，廖华军 ，李德森 ，吴水生

（1.福建中医药大学附属第三人民医院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

钩吻［Gelsemium elegans （Gardn.et Champ.） Benth.］又名断肠草、野葛、大茶药等，为马钱科胡蔓藤属植物，是世界著名的有毒植物。中医对其早有记载与应用，《神农本草经》将其列为下品，主金疮、乳痓、中恶风、咳逆上气、水肿、杀鬼疰蛊毒。现代研究表明钩吻具有抗肿瘤、镇痛、增强免疫、促进造血等作用，特别在无成瘾性镇痛和抗肿瘤等方面具有明显的优势［1］。但钩吻的毒性较大，且其治疗量和中毒量非常接近，安全指数小，剂量不易控制，容易发生中毒反应，每年均不乏钩吻中毒的临床报道［2］，限制其临床的广泛应用。国内外学者通过多种途径探索降低钩吻不良反应的方法，均未从根本上解决钩吻的毒性问题［3-5］。中医对中药的毒性研究历史悠久，积累了许多宝贵经验，其中应用方剂的药物配伍佐制是药物减毒增（存）效的有效方法之一。抵当汤是《伤寒论》中治疗太阳蓄血证的良方，因此我们尝试应用抵当汤中药物的配伍佐制作用，通过小鼠急性毒性实验观察抵当汤是否对钩吻具有减毒作用。结合课题组前期研究的羊血血清、血浆及血细胞对钩吻减毒效应的实验，发现羊血血浆具有减毒效应，而血清及血细胞无此功能；且钩吻中毒后表现为呼吸减慢直至衰竭，靶器官在肺，故初步选择观察肺组织，以期了解钩吻中毒与抵当汤解毒机制。

1 实验材料

1.1 动物 健康昆明种6～8周龄小鼠，雌雄各半，体质量（20±2）g，由福建医科大学实验动物中心代购，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2012-0002。

1.2 试药 钩吻采自福建省龙岩市胡蔓藤种植基地；抵当汤（水蛭、大黄、虻虫、桃仁）购自福建中医药大学国医堂医院，均经福建中医药大学黄泽豪老师鉴定。

1.3 仪器 FA20004N电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；RE-52型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；HH-8型数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；KQ-500E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；WD-3000全自动血液分析仪（吉林维尔医疗器械有限公司）；KH-Q2016组织切片机（阔海医疗科技有限公司）；FY135中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

2 方 法

2.1 药物制备

2.1.1 钩吻提取液的制备 参照本课题组前期的提取方法［6-7］：称取同一植株钩吻粗粉适量，用5倍量的90%乙醇浸泡0.5 h，加热回流提取2次，每次1 h，过滤，收集2次提取液，减压浓缩回收乙醇，至无醇味后，定容得到含生药量为0.3 g／mL的钩吻提取液，于4℃冷藏备用。

2.1.2 抵当汤醇提液的制备

2.1.2.1 抵当汤各药材的提取 ① 大黄的提取：参考文献［8］，称取16 g大黄粉末，用5倍量的95%乙醇，加热回流提取3次，第1次2 h，第2、3次1.5 h，过滤，合并3次提取液，减压浓缩回收乙醇，至无醇味后，定容至1 g／mL，于4℃冷藏备用。② 桃仁的提取：参考文献［9］，称取桃仁饮片 2 g，加 6倍量水，水沸腾后，煎煮2次，每次30 min，过滤，合并2次提取液，减压浓缩，定容至 1 g／mL，于 4℃冷藏备用。③ 水蛭的提取：参考文献［10-11］，称取16 g水蛭，用10倍量70%乙醇浸泡4 h，第1次回流提取2 h，第2、3次用8倍量的70%乙醇回流提取1.5 h，过滤，收集3次提取液，减压浓缩回收乙醇，至无醇味后，定容至1 g／mL，于4℃冷藏备用。④虻虫的提取：参考文献［12］，称取已去翅足的虻虫1 g，先用30倍量的95%乙醇脱水2 h，过滤，再用30倍量的丙酮脱脂2 h，将已脱水脱脂的虻虫放置过夜，干燥研磨，于30倍量的0.01 mol／L盐水中，浸泡12 h连续3次，过滤，收集3次浸液，减压浓缩，定容至1 g／mL，于4℃冷藏备用。

2.1.2.2 醇提液的制备 抵当汤组成：大黄三两，水蛭三十个，虻虫（去翅足）三十个，桃仁二十个，参考《伤寒论》原方的一次给药量换算剂量为：大黄16 g，桃仁 2 g，水蛭 16 g，虻虫 1 g［13］。将上述大黄、桃仁、水蛭、虻虫的提取液按全方的比例准确量取，均匀混合，浓缩至3.5 g／mL，于4℃冷藏备用。

2.1.3 抵当汤水提液制备 按照传统方法将抵当汤四种药材（剂量如“2.1.2.2”）加1 L纯水混合浸泡0.5 h，大火煮开，小火熬至药液 3／5，去渣，通过旋转蒸发仪按40∶1比例蒸发浓缩至3.5 g／mL，于4℃冷藏备用。

2.2 小鼠急性毒性实验

2.2.1 中毒死亡的判定 参见文献［14］，小鼠灌服小剂量的钩吻提取液3～4 min后，其主要表现为安静、发抖、四肢无力及运动失调，呼吸减慢而有间歇，40 min之后基本恢复正常。小鼠灌服大剂量的钩吻提取液3～4 min后，其表现与上所述情况一致，但时间很短暂，随即转向兴奋状态，叩牙频繁，并伴有痉挛，到后期痉挛强度更大，继而间歇性惊厥、跳跃，出现全身性剧烈的强直性惊厥，最后呼吸衰竭而死亡［14］。

2.2.2 急性毒性预实验 取小鼠12只，随机分成3组，每组 4只，禁食 24 h，自由饮水，分别按 1.5、1.2、1 g／kg的剂量予钩吻提取液灌胃，观察并记录小鼠24 h内的中毒症状和死亡情况，确认引起100%（Dm）死亡率的剂量。

2.2.3 急性毒性实验 将72只小鼠随机分成9组，钩吻组（给药剂量为预试Dm剂量，下同）、抵当汤水提液组、抵当汤醇提液组、先钩吻后抵当汤水提液组、先抵当汤水提液后钩吻组、钩吻与抵当汤水提液混合组、先钩吻后抵当汤醇提液组、先抵当汤醇提液后钩吻组、钩吻与抵当汤醇提液混合组，每组8只，用苦味酸标记，实验前禁食不禁水24 h，然后各组小鼠按照“2.2.2”中计算所得的剂量进行一次性灌胃给药，观察并记录小鼠24 h内的中毒症状和死亡情况。

2.3 钩吻配伍抵当汤对小鼠血液、肺组织的影响

2.3.1 分组干预 将40只小鼠随机分成5组，空白组、钩吻组、抵当汤醇提液组、先钩吻后抵当汤醇提液组、钩吻与抵当汤醇提液混合组，每组8只，用苦味酸标记，实验前禁食不禁水24 h，然后各组小鼠按“2.2.2”方法进行一次性灌胃给药。小鼠出现中毒症状时眼球后静脉丛取血，未出现中毒症状的小鼠给药后10 min内眼球后静脉丛取血，并进行肺组织取材。

2.3.2 血清指标检测 检测小鼠白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、血小板（PLT）、乙酰胆碱（ACH）、乙酰胆碱酯酶（CHE）活力变化情况。

2.3.3 肺组织HE染色 取小鼠肺组织，大体观察后以4%多聚甲醛固定，石蜡包埋。待石蜡凝固后，进行病理组织切片，苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，封片，光镜下观察，每张切片200倍镜下随机选5个视野进行拍片。

3 结 果

3.1 急性毒性预实验 急性毒性预实验结果表明，钩吻不同剂量给药后，小鼠出现痉挛、惊厥、跳跃，最后呼吸衰竭而死，死亡时间均在给药后30 min内。当钩吻剂量≥1.5 g／kg时，小鼠死亡率均为100%，见表 1，故确定钩吻的Dm剂量为1.5 g／kg，进行下一步急性毒性实验。

表1 钩吻的急性毒性预实验结果

3.2 各组急性毒性实验情况比较结果显示予1.5 g／kg钩吻后小鼠全部死亡。当配伍抵当汤后，小鼠死亡率均下降，且死亡时间亦明显延长，与钩吻组比较有显著性差异（P＜0.05），见表2。综合实验结果，选用钩吻配抵当汤醇提液进一步考察其减毒作用。

3.3 钩吻配伍抵当汤对小鼠血清指标的影响 如表3所示，进一步考察药物对小鼠血液影响，发现钩吻组小鼠RBC、PLT、HGB、ACH均与空白组呈显著性差异（P＜0.05），抵当汤钩吻混合液组小鼠RBC、PLT、HGB、ACH 均与钩吻组呈显著性差异（P＜0.05），而与空白组无显著性差异；而抵当汤与钩吻给药前后对白细胞、乙酰胆碱酯酶活力却并无影响。

3.4 小鼠肺组织形态学变化 空白组小鼠的肺组织可见细支气管与小静脉；细支气管及其分支和肺泡、肺泡壁、肺间质结构正常，未见充血、水肿、纤维素渗出，无炎症细胞浸润。钩吻组肺组织可见细支气管、肺泡壁、肺间质见大量中性粒细胞浸润伴充血，肺泡壁毛细血管扩张充血，肺泡腔浆液、红细胞等渗出，可见局灶性肺组织实变。钩吻与抵当汤醇提液混合给药后小鼠肺组织可见细支气管、肺泡壁、肺间质中性粒细胞浸润伴充血减轻，肺泡壁毛细血管扩张不明显，肺泡腔渗出减少，肺组织局灶性实变消失。见图1。结果表明抵当汤与钩吻混合后可以降低钩吻的毒性，改善小鼠肺组织中毒症状。

表2 各组急性毒性实验情况比较

表3 钩吻配伍抵当汤对小鼠血液、肺组织的影响（x±s）

4 讨 论

通过急性毒性实验结果表明，抵当汤能减缓钩吻毒性，而传统水煎和醇提方式抵当汤解钩吻毒时，发现醇提抵当汤解毒效果高于传统水煎剂，这是否与传统水煎方法高温久煎破坏水蛭与大黄的有效成分有关，有待进一步实验考察。

血清指标检测结果表明，小鼠灌服钩吻后ACH浓度升高，而CHE活力并未受影响。先灌服钩吻后给抵当汤也造成ACH浓度升高，而直接抵当汤给药者ACH亦有升高趋势，说明抵当汤减钩吻毒性可能不是通过降低ACH而解毒的。在小鼠灌服钩吻后造成血液中白细胞、血红蛋白、血小板等出现不同程度降低，并从肉眼观察亦出现溶血现象。而抵当汤与钩吻混合给药后并未造成小鼠白细胞、血红蛋白、血小板等影响，因此可以推测钩吻中毒可能是钩吻生物碱在小鼠胃肠道中迅速进入血管，与小鼠某些功能蛋白结合且破坏血小板，通过血液循环造成呼吸衰竭而致死。先灌服抵当汤再灌钩吻和灌服钩吻抵当汤混合液大大减少小鼠的死亡率，说明抵当汤可能提前结合（或络合）钩吻生物碱，且被结合（或络合）的生物碱在抵当汤作用下失去毒性，使其灌胃后具有毒性的生物碱减少；也可能抵当汤与钩吻一同进入血液循环时，促使钩吻生物碱不能与小鼠血液中的功能蛋白结合，保护了机体组织，从而起到减毒作用，但具体机制可待进一步研究其血液中蛋白组学。

图1 各组小鼠肺组织HE染色图（×200）

通过考察钩吻与抵当汤先后顺序给药，抵当汤水提液与醇提液均可降低小鼠死亡率，延长小鼠死亡时间，抵当汤可以减钩吻毒性，其中先灌服抵挡汤后钩吻者效果更佳。不同提取方式的抵当汤减钩吻毒性时，醇提抵当汤比传统水煎减毒效果更优。