非小细胞肺癌表皮生长因子受体和ALK基因检测及其与临床病理特征的相关性

陈琳 郭华 孙亚丽 徐瑞

1 陕西省人民医院病理科（西安710068）；2陕西省肿瘤医院内科一病区（西安710061）

肺癌是世界范围内发病率和病死率最高的恶性肿瘤，其中约80%为非小细胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC），手术切除是治疗NSCLC的首选方法，但一部分患者确诊时已错过了最佳的手术时机，多数接受了手术的患者仍需要辅助放化疗，而传统的放化疗对晚期NSCLC 患者疗效十分有限。研究证实，胸膜侵犯、区域淋巴结转移等都是影响手术切除NSCLC 预后的因素。近年来，随着对分子靶向治疗的深入研究，以表皮生长因子受体络氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）和间变性淋巴瘤激酶抑制剂（ALK-TKI）为代表的分子靶向治疗可显著延长患者的总生存期，由于其见效快、副作用小，目前已被批准用于EGFR/ALK 基因检测阳性晚期NSCLC 患者的一线治疗。本研究回顾性分析陕西省人民医院2015年6月至2017年11月经手术治疗的NSCLC 患者216 例EGFR 基因突变状态及EML4-ALK 融合基因检测情况，分析其与临床病理特征的相关性，探讨NSCLC 患者EGFR 基因及EML4-ALK 融合基因突变的意义，以期指导临床诊断及治疗。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集陕西省人民医院2015年6月至2017年11月收治并病理确诊的NSCLC 患者216 例为研究对象，均经手术切除，术前未经任何化疗、放疗及生物免疫治疗，收集临床病理资料，包括年龄、性别、吸烟史、肿瘤病理类型、分化程度、淋巴结转移及胸膜侵犯情况等。其中男133 例，女83 例；年龄30 ～88 岁，中位年龄62 岁，其中年龄＜60 岁的82 例，年龄≥60 岁的134 例；腺癌173例（低分化84 例，中分化65 例，高分化24 例），鳞癌37 例（低分化13 例，中分化22 例，高分化2 例），其他6 例（包括大细胞癌1 例、腺样囊性癌1 例、腺鳞癌4 例）；吸烟者120 例，不吸烟者96 例；伴区域淋巴结转移者47 例，区域淋巴结未转移者169 例；胸膜侵犯者65 例，无胸膜侵犯者151 例。216 例病例中，所有病例均进行了EGFR 基因检测，突变率为40.7%，其中有99 例病例同时进行了EML4-ALK融合基因检测，6 例存在EML4-ALK 融合基因突变，突变率为6.1%。

1.2 样本准备 手术切除样本经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片厚4 μm，HE 染色，光镜观察，所有样本均经两位及以上高年资病理医师复诊，病理质控确认样本中肿瘤含量超过80%后，每例标本连续切10 张（每张10 μm）白片，不漂洗脱蜡，直接封存于1.5 mL EP 管中备用。

1.3 基因检测方法 采用EGFR 基因突变定性试剂盒（厦门艾德生物医药科技有限公司）和ALK融合基因定性检测试剂盒（厦门艾德生物医药科技有限公司），进行EGFR 基因和ALK 基因检测。检测按照试剂盒说明书，肿瘤组织石蜡切片采用过柱法提取DNA 和RNA，通过扩增阻滞突变系统（ARMS-PCR 法）对样本DNA 中EGFR 基因突变进行检测，RT-PCR 方法对样本RNA 中ALK 基因融合进行检测。从而观察及分析NSCLC 组织中EGFR 基因突变及EML4-ALK 融合基因表达状况。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0 软件进行统计学分析，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验或Fisher 确切概率法对EGFR 基因突变和EML4-ALK融合基因表达状况及相关临床病理信息进行分析，多因素分析采用Logistic 回归模型进行多变量分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR 基因检测状况 216 例NSCLC 患者中，EGFR突变率为40.7%（88/216），其中19del和21L858R是主要的突变类型，其突变率分别为20.4%和15.7%；其他突变类型少见，总的突变率仅为4.6%，包括21L861Q、18G719X、20S768I、20T790M和20ins。总体来说，敏感突变的突变率为38.0%，包括19del、21L858R、18G719X、20S768I 和21L861Q；原发耐药突变的突变率为1.4%，包括20T790M 和20ins。所有患者中，具有EGFR 双突变的患者共3 例，分别为2 例19-del/21L858R 双突变以及1 例18G719X/20S768I 双突变。见表1。

表1 NSCLC 患者EGFR 基因突变情况Tab.1 Mutation of EGFR gene in NSCLC patients

2.2 NSCLC 患者EGFR 基因突变状况与临床病理特征的关系 本研究分析了216 例NSCLC 患者年龄、性别、吸烟史、病理类型、区域淋巴结转移情况以及胸膜侵犯情况与EGFR 基因突变状态间的关系（表2）。结果表明，女性患者EGFR 突变率明显高于男性（P=0.001）；不吸烟人群突变率明显高于吸烟人群（P＜0.001）；腺癌患者EGFR 突变率明显高于非腺癌患者（P＜0.001）；有胸膜转移者更易检测到EGFR 突变（P=0.004）。而在关于年龄、分化程度以及是否有区域淋巴结转移的分析中，差异均不具有统计学意义（P＞0.05）。为了排除混杂因素，笔者将性别、吸烟史、病理类型以及胸膜转移情况纳入Logistic 多因素回归分析，结果显示，吸烟史和病理类型是EGFR 突变的独立影响因素，即EGFR 基因突变更易发生于无吸烟史及腺癌患者（表3）。

表2 EGFR 突变状态与临床病理特征的关系Tab.2 Relationship between EGFR mutation and clinicopathological features例

表3 EGFR 突变状态与临床病理特征关系的Logistic 多因素回归分析Tab.3 Logistic multivariate regression analysis of the relationship between EGFR mutation and clinicopathological features

2.3 NSCLC 患者EML4-ALK 融合基因表达状况与临床病理特征的关系 99 例NSCLC 患者进行了EML4-ALK融合基因突变检测，其中6例存在EML4-ALK 融合基因突变，其突变率远低于EGFR 基因突变率（χ2=38.998，P＜0.001）。EML4-ALK融合基因突变率年龄＜60 岁的患者突变率高于年龄≥60 岁者；女性突变率高于男性；无吸烟史者高于有吸烟史者；腺癌患者高于非腺癌患者；低分化者高于中、高分化者，但差异均无统计学意义。另外，本研究对EGFR 阴性的患者EML4-ALK 融合基因突变情况进行统计，发现在EGFR 阴性患者中，ALK的突变率提高到10.0%。在99 例同时检测了EGFR 基因突变和EML4-ALK 融合基因表达的NSCLC病例中，未发现EGFR 基因与EML4-ALK 融合基因共突变的患者。见表4。

表4 ALK 突变状态与临床病理特征的关系Tab.4 The relationship between ALK mutation and clinicopathological features 例

3 讨论

早期NSCLC 根治性手术是最有效的治疗手段，但一部分患者确诊时已错过了最佳的手术时机，尤其是当出现胸膜侵犯或淋巴结转移时，即失去根治性手术治愈的机会。对这部分患者，临床多辅以放、化疗，而传统的放化疗对晚期NSCLC 患者疗效十分有限。近年来，分子靶向治疗因其特异性高、不良反应轻，从而开启了肺癌治疗的新时代。对各类靶向分子突变患者相关临床病理特点的研究有助于筛查出更多靶向治疗受益患者。目前，EGFR 基因突变和EML4-ALK 基因重排是NSCLC 最重要的两个驱动基因，也是NSCLC 进行分子靶向治疗必要的预测指标。

EGFR 属于表皮生长因子受体家族，是一种具有酪氨酸激酶活性的糖蛋白跨膜受体，是原癌基因Her-1 的表达产物，位于7 号染色体短臂的12-14区，与肿瘤的生长、转移密切相关。有研究［1］表明，NSCLC 患者中EGFR 基因突变可持续活化EGFR 酪氨酸激酶，促进肿瘤的增殖、抑制肿瘤细胞凋亡。针对EGFR 突变而设计的特定靶向药物EGFR-TKI 是最先被成功开发为抗肿瘤靶向治疗的药物之一，其中吉非替尼（gefitinib）、厄洛替尼（erlotinib）、埃克替尼（icotinib）等TKI 药物可以通过对肿瘤细胞EGFR 的特异性结合阻断细胞信号转导通路，从而达到抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋亡的目的，已被广泛应用于临床。

EGFR 突变状态与EGFR-TKI 治疗疗效密切相关，不同EGFR 突变类型对EGFR-TKI 的反应率也不尽相同。研究表明，19del 突变患者接受EGFRTKI 的疗效优于L858R 突变患者；20ins 和T790M突变与EGFR-TKI 原发及继发耐药有关；而L861Q、G719X、S768I 等其他突变类型患者对EGFR-TKI 的反应性低于19del 和L858R 突变患者，突变率较低，且常常倾向于以联合突变的形式存在［2］。因此，深入分析EGFR 突变状态及突变类型与EGFR-TKI治疗疗效密切相关。临床最常见的突变类型包括19 外显子缺失突变及21 外显子L858R 突变，约占总突变类型的80% ～90%［3］。本研究中，19del 和21L858R 是NSCLC EGFR 最主要的突变类型，本组这两类经典突变约占所有EGFR 突变的88.6%（78/88），与以往的研究结果相一致。耐药基因20ins 和T790M 的突变率分别为0.9%和0.5%。其他突变类型，包括21L861Q、18G719X、20S768I，总的突变率为1.9%。EGFR 双突变患者对EGFR-TKI反应率较19del 和L858R 单突变患者反应率低［4］，因此要特别关注，本组有3 例患者存在双突变，分别为2 例19-del/21L858R 双突变以及1 例18G719X/20S768I 双突变。

据报道，EGFR 在NSCLC 中的基因突变率与人种有关，西方人群EGFR基因突变率为10%～20%，东亚人群EGFR 基因突变率为30% ～50%［5-6］，本研究中，EGFR 基因突变率为40.7%，符合文献报道。以往的研究表明，EGFR 突变更易发生于女性、无吸烟史和腺癌人群中，但区域淋巴结转移、胸膜侵犯以及肿瘤分化程度等与EGFR 突变之间的关系尚存在争议［7］。本研究中，NSCLC患者EGFR基因突变率以女性、不吸烟者、腺癌患者较高，NSCLC 胸膜侵犯者EGFR 突变率高达53.8%，高于无胸膜侵犯者的34.4%，且两者差异有统计学意义；NSCLC 区域淋巴结转移者EGFR 突变率为46.8%，但与无区域淋巴结转移者的39.1%相比，差异无统计学意义；而年龄、分化程度未发现与EGFR 基因突变相关。为了消除混杂因素的影响，提高结论的可靠性，本研究在单因素分析基础上利用多因素Logistic 多元回归分析，筛选出吸烟史和病理类型是EGFR 突变的独立影响因素，即EGFR基因突变更易发生于不吸烟人群及腺癌患者。

ALK 是胰岛素受体超家族中的一员，由染色体2p23 编码，正常情况下在神经系统有表达，该基因异常可导致细胞的过度增殖和细胞凋亡的下调，从而导致肿瘤的发生。EML4 是棘皮动物微管相关样蛋白家族中的一员，位于2 号染色体的p21基因片段。2007年日本学者SODA首次证实EML4-ALK 融合基因为NSCLC 的驱动基因，EML4-ALK融合基因由第2 号染色体短臂插入引起（包括2p21 和2p23），由ALK 基因的3，端与EML4 基因的5，端倒位融合形成，形成ALK 同源或异二聚体，引起构象变化，激活细胞内酪氨酸激酶磷酸化，活化多个细胞内信号通路，参与调解肿瘤发生与转移的多个环节［8］。所有ALK 基因融合都发生在20 号外显子编码的一段序列，而EML4 断裂点则表现出多变性，目前为止，已在不同肿瘤中发现了11 种EML4-ALK 融合基因型。不同EML4-ALK融合基因变体酪氨酸激酶活性程度有明显差异，但均具有恶性转化和致瘤能力。随后以其为有效靶点的ALK 酪氨酸激酶抑制剂克唑替尼（crizotinib）等靶向药物被批准用于EML1-ALK 融合基因阳性的NSCLC 治疗，并取得了一定疗效。

EML4-ALK 融合基因在NSCLC 中的阳性率是否存在种族和地域差异目前尚无定论，西方国家高加索人的表达阳性率为0.4% ～2.7%，亚裔人群NSCLC 患者阳性率为4.1%～5%，我国的阳性率为4.6%～12.04%［9-10］。有学者认为，亚裔人群EML4-ALK 基因融合发生率略高于高加索人群。本研究中，99 例NSCLC 患者EML4-ALK 融合基因阳性表达率为6.1%，与文献报道结果大致相符。目前，EML4-ALK 融合基因在NSCLC 中的表达与临床病理因素的关系目前尚无定论。WANG 等［11］通过对4 511 例NSCLC 患者的EML4-ALK 融合基因检测结果进行Meta 分析后得出，EML4-ALK 融合基因阳性多发生于女性、无吸烟史、腺癌患者。也有文献报道EML4-ALK 融合基因阳性的患者通常为年轻、男性、无吸烟史、腺癌患者［12］。本组研究中，年龄＜60 岁、女性、无吸烟史、腺癌患者EML4-ALK融合基因突变率高于年龄≥60 岁、男性、不吸烟人群、非腺癌患者，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。究其原因可能与本研究标本量不够大，以及EML4-ALK 融合基因阳性样本量偏少有关。

EGFR 基因突变和EML4-ALK 融合基因重排在多数情况下被认为是独立的分子事件，相互排斥。有学者发现在无吸烟史并且EGFR 未检测到突变的NSCLC 患者，EML4-ALK 融合基因检出率高达33%；其中34 个EGFR-TKI 耐药者有29%检出了EML4-ALK 融合基因［13］。亦有研究［14］表明厄洛替尼不能抑制EML4-ALK 阳性的NSCLC 细胞株H3122 增殖，于是推测EML4-ALK 融合基因可能是EGFR-TKI 原发耐药的分子因素之一。然而近年来陆续有二者共存的病例报道，说明ALK 与EGFR基因突变并不是绝对彼此之间互相排斥，个别患者可能会有ALK 与EGFR 双基因突变的产生［15］。本研究同时对99 例NSCLC 病例进行EGFR 基因突变与EML4-ALK 融合基因检测，未发现ALK 和EGFR 双突变的病例。