miR-17-5p靶向PTEN促进非小细胞肺癌吉非替尼耐药

罗凯 黎谢梦丹 郑国沛 刘浩 贾小婷 王倩 张志杰 贺智敏

广州医科大学附属肿瘤医院/广州医科大学肿瘤研究所（广州510095）

肺癌是严重威胁大众健康的重要恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占80% ～85%。目前，以吉非替尼为代表的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）已成为EGFR 突变型NSCLC 的重要全身治疗手段之一，然而无可避免的EGFR-TKI 耐药严重影响了其临床应用［1］。目前仍有相当比例患者耐药机制未明［2］。因此，进一步寻找EGFRTKI 耐药靶标，阐述耐药机制对于有效逆转EGFRTKI 耐药，提高肺癌综合治疗效果具有十分重要的理论意义和潜在的应用价值。

miRNA 是一类20 bp 左右的单链小分子RNA，其主要通过与靶基因mRNA 的3′非翻译区的部分或完全结合来抑制靶基因mRNA 的翻译过程或促进其降解。越来越多的研究表明miRNA 在肿瘤的发生、发展和治疗中发挥了重要的作用［3-4］。该研究前期已利用吉非替尼敏感NSCLC 细胞HCC827成功构建了继发耐药细胞株HCC827/G 且还排除了目前已知的主要耐药机制在HCC827/G 吉非替尼耐药中的作用，如EGFR 基因T790M 突变等，同时二代测序结果显示HCC827 和HCC827/G 细胞外泌体miRNA 表达谱存在很多差异，其中miR-17-5p在HCC827/G 细胞中表达升高，提示其可能与吉非替尼耐药相关［5］。近来研究表明miR-17-5p 是一种癌基因，促进了多种肿瘤的发生与发展［6］。因此该研究拟证实miR-17-5p 介导NSCLC 吉非替尼耐药的作用并探讨其可能机制，旨在寻找新的耐药靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料 HCC827 细胞株购自中国科学院上海细胞所，HCC827/G 细胞为前期通过低浓度吉非替尼持续诱导HCC827 细胞构建。吉非替尼治疗前血清4 例与治疗耐药后血清3 例均收集自2016年至2017年间广州医科大学附属肿瘤医院确诊的NSCLC 患者，其中男3 例，女4 例，年龄57 ～81 岁。

1.2 试剂和仪器 1640 培养基、胎牛血清购自BI。吉非替尼购自MCE。QRT-PCR 试剂购自TaKaRa。miR-17-5p 相关引物、mimics 和inhibitor、PTEN shRNA、PTEN 3′UTR 区双荧光素酶报告基因质粒均购自复能。PTEN 抗体购自CST。lipo2000购自Thermo。凋亡检测试剂购自联科。荧光定量PCR仪购自伯乐。流式细胞仪购自BD。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 细胞使用含10%胎牛血清的1640 培养基在37 ℃、5%CO2条件下培养，3 d 传代一次。取对数生长期细胞进行相关实验。

1.3.2 QRT-PCR 依说明书提取样品RNA，测浓度后取1 μg 转录为cDNA。以U6 或β-actin 作为内参，设3 个复孔。引物：人β-actin：F：ATGATGATATCGCCGCGCTC，R：CCACCATCACGCCCTGG；人PTEN：F：TCCCAGACATGACAGCCATC，R：GCTTTGAATCCAAAAACCTTACTAC。U6、miR-17-5p 引物序列复能公司未提供。反应条件：95 ℃10 min；95 ℃10 s、60 ℃20 s（采集荧光）、72 ℃10 s，45 个循环；融解曲线分析。利用2-△△CT法计算各指标的相对表达量。

1.3.3 细胞转染 依据lipo2000 说明书步骤完成细胞转染，QRT-PCR与Western Blot检测转染效果。

1.3.4 MTS 实验 取对数生长期细胞接种96 孔板，待细胞贴壁后各孔中分别加入梯度浓度吉非替尼，继续培养48 h 后每孔加入20 μL MTS 试剂，测OD 值后绘制药敏曲线并计算IC50值。

1.3.5 细胞凋亡分析 取对数生长期细胞，加入低浓度吉非替尼作用12 h 后，依说明书步骤将细胞染色后上流式细胞仪检测，结果使用FlowJo 7.6软件分析。

1.3.6 Western Blot 检测 取对数生长期细胞提取总蛋白。BCA 法测定蛋白浓度后取20 μg 蛋白行SDS-PAGE 电泳。电泳结束后转膜、封闭，然后一抗4 ℃孵育过夜，次日孵二抗后曝光显影。

1.3.7 双荧光素酶报告基因实验 将miR-17-5p mimics 分别与对照质粒和PTEN3′UTR 区双荧光素酶报告基因质粒共转染12 孔板中的对数生长期293T 细胞，设置3 个复孔，72 h 后取上清检测荧光素酶活性，以GLUC 为报告基因、SEAP 为对照基因，计算对照组和实验组的相对荧光素酶活性。

1.3.8 生物信息学分析 利用Targetscan 数据库预测miR-17-5p 的靶基因。

1.4 统计学方法 利用SPSS 13.0 软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差表示，计量资料组间比较采用t检验，率的比较采用χ2检验，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-17-5p 在耐药HCC827/G 细胞中表达增高 QRT-PCR 结果显示miR-17-5p在耐药HCC827/G 细胞中表达增高，与前期二代测序结果相符，提示miR-17-5p 可能参与介导吉非替尼耐药（图1）。

图1 miR-17-5p 在HCC827 和HCC827/G 细胞中的表达Fig.1 Expression of miR-17-5p in HCC827 and HCC827/G cells

2.2 miR-17-5p 介导了HCC827/G 细胞对吉非替尼的耐药 HCC827 细胞中过表达miR-17-5p 后（图2A），细胞对吉非替尼的IC50值为（27.48±4.04）μmol/L，较对照组的（2.70 ± 0.86）μmol/L 明显增高（图2B），提示细胞耐药性增加。在HCC827/G 细胞中敲低miR-17-5p 后（图2C），25 μmol/L 吉非替尼对细胞的相对抑制率较对照组明显增加（图2D），提示细胞耐药性降低。表明miR-17-5p 介导了HCC827/G 细胞的吉非替尼耐药。

图2 HCC827 和HCC827/G 细胞分别转染miR-17-5p mimics 和inhibitor 后的耐药性变化Fig.2 Changes of drug resistance after HCC827 and HCC827/G cells transfected with miR-17-5p mimics and inhibitor，respectively

2.3 miR-17-5p 抑制了吉非替尼诱导的肺癌细胞凋亡 HCC827 过表达miR-17-5p 后，细胞凋亡率较对照明显减少（图3A）。HCC827/G 敲低miR-17-5p 后，细胞凋亡率较对照明显增加（图3B）。表明miR-17-5p 可降低吉非替尼诱导细胞凋亡的效果。

图3 HCC827 和HCC827/G 细胞分别转染miR-17-5p mimics 和inhibitor 后的细胞凋亡变化Fig.3 Apoptosis of HCC827 and HCC827/G cells transfected with miR-17-5p mimics and inhibitor，respectively

2.4 miR-17-5p靶向抑制PTEN介导HCC827/G细胞对吉非替尼的耐药 生信分析预测到PTEN 为miR-17-5p 的靶基因（图4A）。QRT-PCR 与Western Blot 结果均显示PTEN 在HCC827/G 中的表达较HCC827 明显降低（图4B、4C）。当HCC827 过表达miR-17-5p 后，PTEN 表达明显下调（图4D、4E）。双荧光素酶报告基因实验结果显示转入miR-17-5p mimics 后，实验组相对荧光素酶活性较对照组明显下降（图4F）。提示miR-17-5p 可靶向抑制PTEN 基因的表达。

在HCC827 中敲低PTEN 后（图4G），3.13μM吉非替尼对细胞的相对抑制率较对照组明显降低（图4H），提示PTEN 参与介导吉非替尼耐药。进一步功能阻断实验结果显示，同时敲低PTEN 可逆转单独敲低HCC827/G 的miR-17-5p 表达导致的吉非替尼耐药性降低（图4I）。以上结果表明miR-17-5p 通过靶向抑制PTEN 介导了HCC827/G 细胞对吉非替尼的耐药。

图4 miR-17-5p 靶向抑制PTEN 介导HCC827/G 细胞对吉非替尼的耐药Fig.4 miR-17-5p mediated HCC827/G cell resistance to gefitinib by inhibiting the expression of PTEN

2.5 吉非替尼耐药后NSCLC 患者血清miR-17-5p表达水平升高 QRT-PCR结果显示3例吉非替尼耐药后NSCLC患者血清中miR-17-5p的表达水平明显高于4 例吉非替尼治疗前NSCLC 患者。见图5。

3 讨论

图5 吉非替尼耐药后NSCLC 患者血清中miR-17-5p 表达水平的变化Fig.5 Changes of serum miR-17-5p expression in NSCLC patients of gefitinib resistance

NSCLC 约占肺癌的80% ～85%且发现时大多患者已处于晚期而失去手术治疗的机会，化疗是其最主要的全身治疗方式，但是明显的毒副作用限制了化疗在晚期NSCLC 治疗中的作用。近年研究证明［7］，使用EGFR-TKI 靶向治疗EGFR 基因突变型NSCLC 可获得较化疗更好的疗效且毒副作用小，因此其已成为另一种重要的NSCLC 全身治疗方式。吉非替尼为EGFR-TKI 的代表性药物。然而，大部分NSCLC 的EGFR-TKI 靶向治疗会在12个月左右出现耐药，这严重影响了其临床应用［8］。目前已发现的耐药机制主要包括三个方面［8］：（1）二次EGFR 基因突变，如T790M 突变；（2）下游旁路信号途径激活，如Kras 基因突变、MET 扩增等；（3）组织学类型的转化，如NSCLC 转化为小细胞肺癌等。但仍有近30%的患者耐药机制不明。因此，进一步寻找EGFR-TKI 耐药靶标并阐明其耐药机制对于逆转EGFR-TKI 耐药具有重要意义。

HCC827 是EGFR 基因19del 突变且对吉非替尼敏感的人NSCLC 细胞株。该研究前期不仅成功构建了吉非替尼继发耐药细胞株HCC827/G，而且还排除了目前已知的主要耐药机制在HCC827/G吉非替尼耐药中的作用［5］。提示HCC827/G 中还存在着新的吉非替尼耐药机制。通过分析外泌体二代测序结果，该研究发现miR-17-5p 在HCC827/G外泌体中的含量增加，进一步QRT-PCR 实验证实miR-17-5p在HCC827/G细胞中的表达也增加，提示miR-17-5p可能介导了HCC827/G的吉非替尼耐药。

miR-17-5p 属于miR-17-92 miRNA 簇。有研究［9］报道miR-17-92 miRNA 簇在多种肿瘤中发挥了癌基因的作用，miR-17-92 miRNA 簇的过表达是关键致癌事件。CHEN 等［10］研究发现miR-17-5p在81 例鼻咽癌患者肿瘤组织中高表达，且高表达miR-17-5p 患者的总生存时间较低表达患者明显缩短。宋先璐等［11］报道miR-17-5p、miR-92a 和let-7b 在顺铂耐药NSCLC 细胞株中表达升高，该组miRNA 通过抑制细胞凋亡和促进细胞增殖介导了NSCLC 的顺铂耐药。以上研究表明miR-17-5p 在多种肿瘤中发挥了癌基因的作用，miR-17-5p 参与了肿瘤的发生、发展、转移以及化疗耐药等生物学过程。然而关于miR-17-5p 与非小细胞肺癌EGFR-TKI靶向治疗耐药的相关研究报道尚未见报道，该研究首次发现miR-17-5p参与介导了非小细胞肺癌的EGFR-TKI 靶向治疗耐药。BOBBILI 等［12］报道miR-17-5p 可以通过外泌体和细胞外囊泡的形式向细胞外释放以实现细胞间的通讯并执行相关生物学功能。该研究前期就以吉非替尼敏感和耐药细胞的外泌体作为研究对象，通过分析发现了miR-17-5p在耐药细胞外泌体中的高表达状态。然后该研究进一步通过QRT-PCR证实了miR-17-5p在耐药细胞内的高表达状态。后续实验发现在敏感的HCC827 细胞中转入miR-17-5p mimics 后细胞对吉非替尼的IC50值明显增加且细胞凋亡率降低，而耐药的HCC827/AR 细胞中转入miR-17-5p inhibitor 后吉非替尼对细胞的抑制率明显增加且细胞凋亡率增加，这从正反两个方面证实miR-17-5p 介导了NSCLC的吉非替尼耐药，且该过程可能是通过miR-17-5p靶向调控凋亡相关基因来实现的。

BOBBILI 等［12］综述了已有报道的miR-17 靶基因，其中与凋亡调控相关的基因有PTEN 与P21等。该研究通过生物信息学分析也预测到了PTEN 为miR-17-5p 的下游靶基因。因此该研究将凋亡相关基因PTEN 选为miR-17-5p 下游靶基因的候选基因进行下一步研究。相关研究［13］报道多种肿瘤中PTEN 基因的缺失或突变可导致PTEN 表达的缺失或下调，而作为负性调控因子，PTEN 表达的缺失或下调可通过激活PI3K/Akt 信号通路来抑制肿瘤细胞的凋亡并促进其增殖，从而促进了肿瘤的发生和发展。该研究显示，PTEN 在吉非替尼耐药细胞株HCC827/G 中表达下调，而在PTEN 高表达的敏感细胞HCC827 中转入miR-17-5p mimics后PTEN表达也明显下调。同时双荧光素酶报告基因实验也证实了miR-17-5p 对PTEN 表达的抑制作用。此外该研究还通过在吉非替尼敏感HCC827 细胞中敲低PTEN 后检测到吉非替尼对细胞的相对抑制率降低和功能阻断实验证实了PTEN 参与了HCC827/G 细胞对吉非替尼的耐药。而这些结果均表明miR-17-5p 可通过靶向抑制PTEN 基因表达介导HCC827/G 细胞对吉非替尼的耐药。

最后，该研究还发现在吉非替尼耐药后的NSCLC 患者血清中的miR-17-5p 表达水平较治疗前升高，提示miR-17-5p 还有望作为耐药监测的指标之一。但由于耐药监测以及标本二次取样困难等原因导致该研究所收集的样品数量偏少，这是该研究的不足，因此该研究下一步拟继续收集耐药后的临床样品以完成后续的更大样品量的临床验证工作。

综上所述，miR-17-5p 通过靶向下调PTEN 基因表达抑制细胞凋亡促进非小细胞肺癌细胞对吉非替尼的耐药，其有望成为吉非替尼耐药新靶点。