交泰丸含药血清对离体豚鼠心室肌细胞膜动作电位的影响*

陈召起，邢作英，王永霞，朱明军，胡宇才，陈 鹏，宋欢欢，郑 佳，任红杰

(1. 河南省人民医院中医科，河南 郑州450003； 2.河南中医药大学第一附属医院心脏中心，河南 郑州 450000)

交泰丸一方首见于明代韩懋《韩氏医通》一书。该书最早记载：“黄连……生用为君，佐官桂少许，煎百沸，入蜜，空心服，能使心肾交于顷刻。”清代王士雄的《四科简效方》始出交泰丸方名，标明黄连肉桂之比为10∶1，有清心除烦、引火归元、交通心肾的作用，对心肾不交之心悸疗效显著。早期的临床观察发现交泰丸对室性早搏[1]及多种原因引起的快速性心律失常有效[2]。目前交泰丸在临床主要被用于病机为心火亢盛、心肾不交之心悸。本实验研究了交泰丸含药血清对离体豚鼠心室肌细胞动作电位的影响，探讨桂枝甘草汤抗心律失常的药理机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

健康SD大鼠20只，雄性，体质量250～350 g，8～12周龄，SPF级，合格证号为SCXK(京)2010-0001，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物屏障系统饲养。健康成年豚鼠，雌雄兼用，体质量250～350 g，10～12周龄，清洁级，合格证号为SCXK(京)2011-0004，由北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司提供，动物屏障系统饲养。

1.2 药品、主要试剂与仪器

黄连(批号20130725)、肉桂(批号20130512)，均为江阴天江药业有限公司产品，由河南中医药大学第一附属医院药房提供，交泰丸中黄连、肉桂的比例为10∶1。氯化钠(NaCl，批号100997803)、氯化钾(KCl，批号1000959400)、氯化钙(CaCl2，批号10035-04-8)、葡萄糖(Glucose，批号1000898954)、羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，批号1001531694)、左旋谷氨酸(L-Glutamic Acid，批号1000985138)、硫酸镁(MgSO4，批号1001386591)、氯化镁(MgCl2，批号1000838831)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA，批号1000960158)、牛磺酸(Taurine，批号1001675865)等，由SIGMA公司提供；Ⅱ型胶原酶(127 500 units/L，批号17101-015)、细胞培养基(Media 199，批号1221478)等，由GIBCO公司提供。Langendorff灌流系统，自制；EPC-10膜片钳系统，德国HEKA公司产品；OLYMPUS IX71倒置显微镜，产地日本；PatchMaster软件，德国HEKA产品。

1.3 动物分组与含药血清制备

将20只大鼠随机分为黄连组、肉桂组、黄连+肉桂组、交泰丸组和空白组(给予等容积生理盐水)5组，每组4只。灌胃药物：按照《四科简效方》交泰丸原方比例黄连∶肉桂(10∶1)配伍[3]，取黄连100 g、肉桂10 g，合并煎煮，得到交泰丸组药液。另取黄连100 g、肉桂10 g，分别煎煮，制备黄连组和肉桂组药液。黄连煎液和肉桂煎液以1∶1比例混合，得到黄连加肉桂组药液。各组煎煮滤液浓缩至100 mL，以10 μL/g 体质量的剂量灌胃给予大鼠，灌胃药量分别为成人的5倍剂量，每日2次；空白组给予等容积生理盐水。末次给药1 h后，以质量分数为100 g/L水合氯醛40 μg/g麻醉，下腔静脉采血，4 ℃ 冰箱放置3 h，3 000 r/m离心15 min，收集血清，置-70 ℃冰箱保存备用[3]。大鼠采血完成后弃去不用。

1.4 检测指标

分离豚鼠心室肌细胞，Langendorff心脏灌流装置出口温度调整为37 ℃，流速为3～4 mL/min。以质量分数为100 g/L水合氯醛30 μg/g麻醉豚鼠，开胸游离并剪取心脏。修剪后逆行插管连于灌流装置上，先以Buffer B (Buffer A加1 mol/L CaCl2，调至1.5 mmol/L) 灌流3 min以去除心脏内残留血液，再以Buffer A (NaCl 136 mmol/L 、KCl 5.4 mmol/L、K2HPO4·2H2O 0.33 mmol/L、MgSO4·7H2O 1.0 mmol/L、Glucose 10 mmol/L、HEPES 10 mmol/L，1 mol/L NaOH 25 ℃下调pH值至7.3～7.4) 灌流1 min去除钙，后改为酶液 (Buffer A 50 mL 、 胶原酶II 25 mg、BDM 25 mg、Carnitine 20 mg、Taurine 31 mg、L-Glutamic Acid 20 mg)，进液约10 mL后酶液循环灌流消化心脏，20 min左右液体拉丝逐渐减少直至结束，心脏松软提示消化完成。剪取心室组织放于KB液(KOH 80 mmol/L、KCl 30 mmol/L、L-Glutamic Acid 50 mmol/L、MgCl21 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、Glucose 10 mmol/L、KH2PO420 mmol/L、Taurine 20 mmol/L、EGTA 0.5 mmol/L，1 mol/L KOH 25 ℃下调pH值至7.3～7.4)中，剪碎成细小组织块，用吸管吹打，使细胞分离，细胞液用200目滤网过滤后备用。实验中分别加入各组含药血清，体积分数为100 mL/L和150 mL/L，置于细胞孵育箱中24 h后进行膜片钳实验[4]，测量各组细胞动作电位。检测指标包括：静息电位(restingpoten-tial,RP)、动作电位幅值(amplitude of action potential,APA)、动作电位 0相最大上升速率(maximal velocity of phase 0 depolarization,Vmax)、动作电位复极50%时程(action potential duration at 50% repolarization,APD50)、动作电位复极90%时程(action potential duration at 90% repo-larization,APD90)、动作电位复极时程(action potential repolarization duration,APD)。

膜片钳实验：实验温度为25 ℃左右，取出细胞，加入细胞外液 (NaCl 140 mmol/L、KCl 3.5 mmol/L、CaCl22 mmol/L、MgCl21 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、Glucose 10 mmol/L、NaH2PO41.25 mmol/L，1mol/L NaOH溶液25 ℃下调pH值至7.4)。拉制玻璃电极，充灌电极内液 (NaCl 5 mmol/L、K-Gluconate 140 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、MgCl2·6H2O 1 mmol/L、EGTA 5 mmol/L、Mg-ATP 2 mmol/L、CaCl20.1 mmol/L，1 mol/L KOH溶液25 ℃下调pH值至7.2)，显微镜下选取完整、横纹清晰的细胞进行实验[5]。

1.5 统计学方法

2 结 果

各组RP、APA、Vmax、APD50、APD90、APD对比见表1。

表1各组动作电位的对比

组 别RP/mvAPA/mvVmax/ (V·s-1)APD50/ msAPD90/msAPD/ms100 mL/L空白组-78.62±1.17140.20±0.55232.10±35.92590.20±60.76646.20±35.24650.20±34.54100 mL/L黄连组-76.69±2.65139.40±2.37267.30±22.98605.50±40.09668.00±49.10666.30±48.59100 mL/L肉桂组 -79.50±1.77138.10±3.44183.50±8.33658.40±39.21697.60±37.15714.60±40.01100 mL/L黄连+肉桂组-61.91±3.72*#△130.30±2.55*#102.10±6.73*#754.20±54.26788.20±53.99805.40±56.02100 mL/L交泰丸组-72.38±0.91130.60±1.71*#134.60±8.43#752.20±51.81764.50±47.01793.30±53.95150 mL/L空白组-81.13±0.64142.10±0.79292.90±27.39550.30±55.78502.70±34.70557.60±44.08150 mL/L黄连组-82.88±0.79139.20±1.04253.60±11.38622.50±37.59669.90±76.52713.30±27.94150 mL/L肉桂组-83.88±1.25142.60±0.85243.30±14.50723.60±45.33751.90±33.32*799.20±40.15*150 mL/L黄连+肉桂组-81.63±0.91128.60±3.56*#△179.30±12.96*760.40±46.73*776.20±54.24*806.80±35.81*150 mL/L交泰丸组-79.38±1.32△130.60±3.62*△210.70±14.33*776.70±36.14*858.70±55.68*824.60±42.70*

注：与空白组对比，*P<0.05；与黄连组对比，#P<0.05；与肉桂组对比，△P<0.05；与黄连加肉桂组对比，＊P<0.05

对RP的影响：各组药物对RP绝对值呈抑制趋势。其中100mL/L黄连+肉桂组抑制最显著(P<0.05)，且与黄连组和肉桂组的组间对比差别亦有统计学意义；150 mL/L组各组与空白组对比，差别无统计学意义。

对APA的影响：各组药物均抑制APA。其中100 mL/L、150 mL/L交泰丸组和黄连+肉桂组与空白组对比，差别有统计学意义(P<0.05)。150 mL/L黄连+肉桂组抑制率最大，为9.5%。100 mL/L交泰丸组、黄连+肉桂组分别与黄连组对比，差别亦有统计学意义(P<0.05)。

对动作电位Vmax的影响：除100 mL/L黄连增大动作电位Vmax外，其余各药物均抑制APA。其中100 mL/L、150 mL/L黄连+肉桂组，150 mL/L交泰丸组与空白组对比，差别有统计学意义(P<0.05)；100 mL/L黄连+肉桂组、100 mL/L交泰丸组与100 mL/L黄连组对比，差别亦有统计学意(P<0.05)；100 mL/L黄连+肉桂组抑制率最大，为56.0% 。

对APD50的影响：各药物均延长APD50。其中150 mL/L黄连+肉桂组、150 mL/L交泰丸组与空白组对比，差别有统计学意义(P<0.05)；150 mL/L交泰丸组延长率最大，为41.1%。

对APD90的影响：各药物均延长APD90。其中150 mL/L肉桂组、150 mL/L黄连+肉桂组、150 mL/L交泰丸组与空白组对比，差别有统计学意义(P<0.05)；150 mL/L交泰丸组延长率最大，为70.8%。

对APD的影响：各药物均延长APD。其中150 mL/L肉桂组、150 mL/L黄连+肉桂组、150 mL/L交泰丸组与空白组对比，差别有统计学意义(P<0.05)；150 mL/L交泰丸组延长率最大，为47.9%。

3 讨 论

黄连主要成分小檗碱有明显抗心律失常作用，能防治乌头碱、电刺激及冠状动脉结扎所致的实验动物室性心律失常，且呈明显的量效关系，还能拮抗肾上腺素及其同类物等在麻醉兔身上引起的心律不齐、心率变慢和心电图的改变[6-8]。肉桂的主要成分桂皮醇具有抗炎、抗氧化及抑制活性氧生成作用。文献[9]报道，肉桂水煎剂对全身血管有扩张作用；桂皮油对兔离体心脏有抑制作用，对末梢血管有持续性扩张作用。

本研究结果显示：100 mL/L黄连+肉桂组抑制RMP、APA最显著(P<0.05)，且对Vmax抑制率最大(P<0.05)；150 mL/L交泰丸组对APD50、APD90和APD延长率最大。细胞静息膜电位是内向整流钾电流(IK1)平衡运动的结果，用药后RMP绝对值减小，提示药物可能具有抑制IK1的作用；钠离子(Na+)快速内流形成快速除极期，药物抑制APA和Vmax，提示药物可能通过抑制INa减慢冲动在细胞间的传导，消除折返发挥抗心律失常的作用。动作电位复极过程是钙离子内流和钾离子外流相互作用的结果，使用药物后APD50、APD90和APD不同程度延长，提示药物可能起到抑制ICa-L和IK的作用，从而延长不应期，提高异常冲动落入有效不应期的概率，有效减少异常冲动的传导，对快速性心律失常的治疗有一定价值[10-12]。

对比各组药物的药理效应发现：单味药物通过一定方法加减组合后，药效优于单味药物的单独应用。提示：中药独特疗效有其独特的物质基础，复方药物加减组合后有一定协同作用，增强了药物的原有疗效，是中药配伍方法“相须”的体现。

综上所述，延长细胞动作电位的APD50、APD90和APD是交泰丸发挥抗心律失常作用的重要电生理机制。此为做进一步药效物质研究提供了实验基础，为交泰丸复方的临床应用提供了参考。