高效液相法测定黄连降糖片中盐酸小檗碱含量

张 健，张蒙蒙

(开封市食品药品检验所，河南 开封475002 )

黄连降糖片为开封市某医院自制制剂，由黄连、酒大黄、知母、麦冬、地黄、牡丹皮组成，具有清热生津、降糖止渴的功效，主治热盛津伤型消渴病。方中黄连清热保津、泻火解毒，是为君药，其有效成分为小檗碱。已有动物实验和临床研究表明作为异喹啉类生物碱，小檗碱具有多种药理作用[1]，可通过促进胰岛B细胞修复作用、拮抗肾上腺素、抑制糖异生、促进葡萄糖酵解、降低胰高血糖素等途径降低血糖，从而改善高血糖症，改善胰岛素耐受性[2]；可降低血清三酰甘油、胆固醇、极低密度脂蛋白，升高SOD活性、抑制醛糖还原酶活性等[3]。 现用质量标准为医院自定标准，标准中无含量测定项。为更好控制其质量、完善标准，本研究采用高效液相法对制剂中盐酸小檗碱进行了含量测定[4-5]。实验结果表明，本法简便、快速、准确，可用于该制剂的含量测定。

1 药品、试剂与仪器

黄连降糖片，0.3 g/片，60片/瓶，编号001，002，003，由开封市某医院提供。盐酸小檗碱对照品，含量为86.8%，由中国药品生物制品检定所提供，批号110713-201613；乙腈、甲醇，均为色谱纯，北京迪玛欧泰科技发展中心产品；磷酸二氢钾，分析纯试剂，天津市致远化学试剂有限公司产品；庚烷磺酸钠，分析纯试剂，天津市光复精细化工研究所生产；磷酸，分析纯试剂，洛阳昊华化学试剂有限公司产品；水为纯化水，本实验室自制。戴安U-3000型高效液相色谱仪，美国赛默飞世尔公司产品；UVIKON-XL紫外分光光度计，法国SECOMAM公司电子天平，量程0.01 mg～220 g，德国Sartorius CP225D产品；C18色谱柱(Agela Promsil，4.6 mm×250 mm，5 μm)，天津博纳艾杰尔科技有限公司产品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

按照文献[6-7]操作。色谱柱为Agela C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-磷酸盐缓冲液[0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液和0.05 mol/L庚烷磺酸钠溶液(1∶1)，含0.2%(L/L)三乙胺，用磷酸调pH值至3.0](41∶59)，流速1.0 mL/min，检测波长263 nm，柱温35.0 ℃，进样量20 μL。理论塔板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于3 000。对照品、阴性对照品和供试品色谱图见图1 。

1.盐酸小檗碱；A.对照品; B.缺黄连阴性对照品; C.供试品图1 对照品、阴性对照品和供试品的HPLC色谱图

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取盐酸小檗碱对照品23.87 mg，置25 mL量瓶中，加沸水溶解，放冷至室温，加水稀释至刻度，摇匀，制成0.954 8 g/L的对照品储备液。精密量取该储备液1 mL，置25 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得含量为38.19 mg/L的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

取供试品10片，精密称定，研细，精密称取细粉0.30 g(约相当于1片)，置50 mL量瓶中，加甲醇约10 mL，超声处理并用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置25 mL量瓶中，加水稀释至刻度，作为供试品溶液。

2.3 稳定性试验

取2.2.2项下供试品溶液，于制备完成后0，1，2，4，6，8，12，24 h分别进样20 μL，结果峰面积RSD=0.6%(n=8)。结果表明:供试品溶液在室温24 h内稳定性较好。

2.4 线性关系考察

分别精密量取对照品溶液2，5，10，20，30，40 μL，按上述色谱条件进行分析，以对照品进样量(X，mg/L)对峰面积(Y)作线性回归，回归方程为：Y=82.40X-0.035(R=0.999 5)。结果表明：盐酸小檗碱在0.076～1.528 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.5 重复性试验

取同一批样品(批号001)，按2.2.2项下方法制得供试品溶液5份，分别测定盐酸小檗碱含量，平均含量为34.77 mg/片，RSD为0.6%。结果表明：本方法重复性良好。

2.6 精密度试验

取对照品溶液，按2.1 色谱条件连续进样6针，以盐酸小檗碱峰面积计算RSD为0.1%。结果表明：仪器精密度良好。

2.7 加样回收率试验

称取已知含量的样品(批号001，测得含盐酸小檗碱34.77 mg /片)细粉6份，每份15 mg，分为3组，每组2份；置10 mL容量瓶，每组分别精密量取对照品储备液(0.954 8 g/L)1.5 ，1.8 ，2.0 mL，加甲醇适量，超声处理并用甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取1 mL，置25 mL量瓶中，加水稀释至刻度，作为加样回收供试品溶液；按2.1项下条件测定，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.8 样品含量测定

分别精密量取3批样品，按供试品溶液制备方法制备溶液，分别进样20 μL，测定盐酸小檗碱含量，结果见表2。

表2 样品含盐酸小檗碱测定结果

3 讨 论

笔者在选择提取溶剂时，根据盐酸小檗碱性质，比较了甲醇、80%甲醇、50%甲醇和水，因甲醇提取效果较好，回收率高，确定其为提取溶剂。在选择检测波长时，取盐酸小檗碱对照品溶液，在200～400 nm波长范围内扫描，结果在263 nm波长处有最大吸收，故选择263 nm为检测波长。在选择流动相时，分别以甲醇-水 (45∶55)、乙腈-0.05%磷酸水溶液(30∶70)、乙腈-磷酸盐缓冲液[0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液和0.05 mol/L庚烷磺酸钠溶液(1∶1)，含0.2%三乙胺，用磷酸调pH值至3.0](41∶59)为流动相对样品进行测定，发现使用乙腈-磷酸盐缓冲液(41∶59)为流动相时，色谱峰的分离度大于1.5，峰形较好，理论塔板数以盐酸小檗碱峰计算不低于3 000，故以此为流动相。