顶空气相色谱法测定乙酰氨基阿维菌素对照品中的残留溶剂

季 璇，戴 青，赵富华，陆连寿，温 芳，王 雷，韩宁宁，张秀英

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

阿维菌素类药物是一类应用极为广泛的广谱高效抗寄生虫药，此类药物能预防和杀灭家畜动物的螨虫、线虫等各种寄生虫。其中阿维菌素B1a和B1b在目前已知的该类药物中药效最强，但阿维菌素类药物具有较大毒性，目前市场上应用的都是阿维菌素的衍生物[1-2]。乙酰氨基阿维菌素(图1)是阿维菌素B1a和B1b的4”位乙酰基取代而得，属大环内酯类体内外杀虫剂[3-5]。默克公司于1997年开发出了应用于奶牛和肉牛的乙酰氨基阿维菌素，使用时无需休药期，且在牛奶中的残留量很低，是高效、广谱和低残留的新一代兽用驱虫药物，保障了优质奶源的供应，在动物医药领域应用广泛[6-8]。

在该药物制备过程中会用到多种有机溶剂，其药物残留量会影响动物源性食品安全，在对照品定值中也必须对溶剂残留量明确定量，保证对照品定值的准确性[9]。乙酰氨基阿维菌素对照品的合成工艺中用了甲醇和丙酮，精制所用的溶剂为乙醇，因此确定甲醇、丙酮和乙醇为残留溶剂测定目标。但《中国兽药典》(2020年版一部)[10]中的残留溶剂测定方法仅对乙醇、乙腈和丙酮进行测定，并未建立本对照品可能产生的残留溶剂甲醇的测定方法，且采用的是直接进样法，而本方法所用的顶空气相色谱法能够避免溶液基质对检测的干扰，对残留溶剂具有富集作用，是一种更高效准确的质量控制方法[11-13]。截止到目前，国家兽药基础数据库中显示持有生产文号的原料药生产企业有7家，注射液生产企业有67家，在原料药和注射液的质量标准中均需用到乙酰氨基阿维菌素对照品，为满足行业需求，保障动物源性食品安全，对该对照品进行制备。本文拟建立测定乙酰氨基阿维菌素对照品中3种残留溶剂的顶空气相色谱检测法，并进行方法学研究。

1 材料与方法

1.1 仪器 Agilent7890气相色谱仪(包括7697A型顶空进样器，安捷伦科技公司)；XP105电子天平(Mettler Toledo公司)。

1.2 试剂 乙醇、甲醇、丙酮对照品(中国计量科学研究院)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF，Thermo Fisher公司，色谱纯)。

1.3 试药 乙酰氨基阿维菌素对照品原料，浙江海正药业股份有限公司。

1.4 溶液的制备

1.4.1 对照品溶液 取乙醇、甲醇和丙酮对照品各约2.5、1.5、2.5 g，精密称定，分别置50 mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，作为甲醇、乙醇和丙酮贮备液。乙醇对照品溶液：精密量取1 mL乙醇贮备液，置50 mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，再精密称取2.5 mL，置50 mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，即得；甲醇对照品溶液：精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，再精密称取2.5 mL，置50 mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，精密量取2.5 mL，置50 mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，即得；丙酮对照品溶液：精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，再精密称取2.5 mL，置50 mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，精密量取2 mL，置25 mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，即得。

1.4.2 供试品溶液 取乙酰氨基阿维菌素约0.5 g，精密称定，置顶空瓶中，精密加DMF 5 mL，摇匀，作为供试品溶液。

1.4.3 空白溶液 取DMF作为空白溶液。

1.4.4 线性与范围试验溶液 分别精密量取乙醇、甲醇和丙酮对照品贮备液适量，用DMF稀释制成浓度分别为974、487、195、98、48、25、11 μg/mL的乙醇对照品溶液、浓度分别为606、303、121、61、30、15、8 μg/mL的甲醇对照品溶液和浓度分别为972、486、194、97、49、24、12 μg/mL的丙酮对照品溶液。

1.4.5 回收率试验溶液 乙醇回收率试验溶液：分别精密量取乙酰氨基阿维菌素9份，每份约0.5 g，3份中分别精密加974 μg/mL的溶液5 mL和DMF 4 mL，3份中分别精密加974 μg/mL的溶液1 mL和DMF 4 mL，3份中分别精密加974 μg/mL的溶液0.2 mL和DMF 4.8 mL作为回收率溶液；甲醇和丙酮回收率试验溶液：分别精密量取乙酰氨基阿维菌素9份，每份约0.5 g，3份中分别精密加606 μg/mL和972 μg/mL的混合溶液5 mL和DMF 4 mL，3份中分别精密加606 μg/mL和972 μg/mL的混合溶液1 mL和DMF 4 mL，3份中分别精密加606 μg/mL和972 μg/mL的混合溶液0.2 mL和DMF 4.8 mL作为回收率溶液。

1.5 色谱条件 色谱柱为Agilent-HP-5毛细管色谱柱(5%苯基-95%甲基聚硅氧烷为固定液)；起始温度50 ℃，保持10 min，再以每分钟10 ℃的速率升温至180 ℃，顶空瓶平衡温度为80 ℃，平衡时间为30 min，高纯氮气为载气，氢火焰离子化检测器为检测器，进样口温度200 ℃，检测器温度为250 ℃。

1.6 灵敏度测定方法 乙醇：检测限溶液：精密量取乙醇对照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，即得，定量限溶液：精密量取1 mL乙醇贮备液，置50 mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，再精密量取1.2 mL，置100 mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，即得；甲醇：检测限溶液：见1.4.1项甲醇对照品溶液配制方法，定量限溶液：精密量取1 mL甲醇贮备液，置100 mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，再精密量取1 mL，置20 mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，即得；丙酮：检测限溶液：精密量取丙酮对照品溶液5 mL，置10 mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，即得，定量限溶液：精密量取1 mL丙酮贮备液，置250 mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，再精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，即得，在1.5项的色谱条件下检测。

1.7 精密度测定方法 乙醇溶液：精密量取乙醇贮备液1.9 mL，置10 mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，再精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，即得；甲醇溶液：精密量取甲醇贮备液1 mL，置100 mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，再精密量取1 mL，置20 mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，即得；丙酮溶液：精密量取丙酮贮备液2.4 mL，置100 mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，再精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，即得，分别精密量取以上溶液各5 mL，置20 mL顶空瓶中，重复测定6次，在1.5项的色谱条件下检测。

2 结果与分析

2.1 专属性 分别精密量取5 mL空白溶液和对照品溶液于20 mL顶空瓶中进行检测，乙醇、甲醇和丙酮与DMF的分离度均大于1.5，表明该条件能够将3种有机溶剂充分富集，能够满足专属性的要求(图2)。

图2 空白溶液(A)、乙醇对照品溶液(B)、甲醇和丙酮的混合对照品溶液(C)气相色谱图Fig 2 Gas chromatogram of blank solution (A), ethanol reference substance solution (B) and a mixed reference substance solution of methanol and acetone (C)

2.2 检测限和定量限 以信噪比为3∶1和10∶1分别作为检测限和定量限，测得乙醇的定量限为11 μg/mL，检测限为5 μg/mL，甲醇的定量限为15 μg/mL，检测限为4 μg/mL，丙酮的定量限为6 μg/mL，检测限为2 μg/mL。

2.3 线性范围与线性方程 分别精密量取乙醇、甲醇和丙酮的线性与范围试验溶液5 mL，分别置20 mL顶空瓶中，每份溶液制备2份，顶空进样， 以

浓度和峰面积作线性曲线，用最小二乘法进行线性回归。结果显示，乙醇在11～974 μg/mL浓度范围内线性关系良好，线性方程为Y=0.34165X-1.5219，r=0.999，甲醇在15～606 μg/mL浓度范围内线性关系良好，线性方程为Y=0.3419X+1.7237，r=0.999，丙酮在12～972 μg/mL浓度范围内线性关系良好，线性方程为Y=1.0804X+4.1559，r=1.000。

2.4 精密度 分别精密量取各精密度试验溶液，置20 mL顶空瓶中，重复测定6次，记录色谱图，结果显示，乙醇峰面积的RSD为10.0%，分别精密量取甲醇和丙酮浓度为15、24 μg/mL的溶液5 mL，重复测定6次，甲醇峰面积的RSD为6.6%，丙酮峰面积的RSD为2.5%(表1)。

表1 精密度试验结果Tab 1 Results of Precision test

2.5 准确度 分别精密量取各浓度回收率试验溶液，置20 mL顶空瓶中，结果显示，乙醇的回收率为92.1%～109.9%，甲醇的回收率为94.4%～109.5%,丙酮的回收率为92.5%～102.4%，均在90%～110%范围内(表2)。

表2 回收率试验结果Tab 2 Results of recovery rate test

2.6 耐用性 在方法研究中，对载气流速、柱温、进样口和检测温度进行了一定范围的变动，结果表明，系统适用性均符合要求，测定结果不受影响。

2.7 样品的测定 取供试品溶液顶空进样，结果显示，供试品甲醇和丙酮的含量均低于定量限，因此可忽略不计，按外标法计算供试品中乙醇的含量为0.05%(表3)。

表3 乙酰氨基阿维菌素残留溶剂测定结果Tab 3 Results of residual solvents of eprinomectin

3 讨论与结论

3.1 进样方式选择 气相色谱法测定样品中的残留溶剂目前有直接进样和顶空进样两种方法。美国药典采用直接进样法对乙酰氨基阿维菌素中的残留溶剂乙腈、甲醇、乙酸异丙酯和庚烷进行测定，广东省兽药饲料质量检验所等2017年采用直接进样法对乙酰氨基阿维菌素产品中的乙醇、乙腈和丙酮三种残留溶剂进行测定[14]，能够满足一定的检验需求，但直接进样法检测过程中溶液基质会对残留溶剂的测定有较大的干扰，而本文所用的顶空气相色谱分析法可以使其气化后进样，气化的残留有机溶剂的浓度与溶液中相比有很大增加，对乙酰氨基阿维菌素对照品中的残留溶剂具有良好的富集作用，能够检测出该对照品中的3种残留溶剂。另外进样室在较低温度下操作，可避免药品组分分解，避免了样品溶液基质的干扰，并可减少样品本身可能对色谱系统带来的严重污染。

3.2 溶剂选择 乙酰氨基阿维菌素在水中几乎不溶，因此本文参照《中国兽药典》一部“0861残留溶剂测定法”的要求，选用N，N-二甲基甲酰胺作为乙酰氨基阿维菌素的溶剂，该溶剂对乙醇、甲醇和丙酮均具有良好的溶解性，且色谱图基线较平直，因此选用N，N-二甲基甲酰胺作为溶剂。

3.3 色谱条件选择 由于乙醇、甲醇和丙酮的沸点均低于80 ℃，N，N-二甲基甲酰胺的沸点远高于80 ℃，且该温度下峰面积稳定，因此确定顶空瓶的平衡温度为80 ℃；对顶空瓶平衡时间进行筛选，结果显示平衡30 min后顶空瓶内气液达到平衡。

本试验所用乙酰氨基阿维菌素对照品的合成工艺中用了甲醇和丙酮，精制所用的溶剂为乙醇，而《中国兽药典》(2020年版一部)中该品种的残留溶剂测定方法仅对乙醇、乙腈和丙酮进行测定，并未建立本对照品可能产生的残留溶剂甲醇的测定方法，本试验采用顶空气相色谱法对乙酰氨基阿维菌素对照品中的3种残留溶剂乙醇、甲醇和丙酮进行了测定，得出了该对照品中乙醇残留溶剂的含量，该方法的分离度、重复性和回收率等指标均满足《中国兽药典》中有机溶剂残留测定法的要求，简便准确，回收率高，为兽药检测技术的发展提供支撑。经测定，对照品中含有乙醇，限度符合药典要求，工艺中虽用到了甲醇和丙酮，但在对照品中未检出。