UFLC-MS/MS法同时测定龙胆中7个活性成分的含量

关 皎，舒欣洋，吴 燕，张雯钰，娄 云，范琢玉，汤鑫淼，朱鹤云，崔 悦*，冯 波*

(1. 吉林医药学院 药学院，吉林吉林 132013；2. 深圳技师学院，广东深圳 518116)

龙胆为龙胆科植物条叶龙胆GentianamanshuricaKitag.、龙胆GentianascabraBge.、三花龙胆GentianatrifloraPall. 或坚龙胆GentianarifescensFranch. 的干燥根和根茎。文献报道，其能抗抑郁、保肝、抗炎、抗氧化、保护心肌等[1-5]。在兽药领域，主治马、牛、驼、羊等兽类的湿热黄疸、目赤肿痛、湿疹瘙痒。兽药制剂如：龙胆泻肝散、龙胆碳酸氢钠片、复方龙胆酊等[6]中也有应用。因此，其质量控制方法研究对于控制龙胆药材以及含有龙胆的复方制剂具有重要意义。《中国兽药典》2015年版中收载的龙胆质量控制指标为龙胆苦苷。然而，龙胆中其他化学成分，如马钱苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷和獐牙菜苦苷、异荭草苷和异牡荆素亦具有多种药理活性[7-12]。因此，对龙胆中的多种活性成分进行质量控制十分必要。课题组前期采用了HPLC、UFLC等多种分析技术建立了相关质量控制方法[13-14]，研究在此基础上，建立了UFLC-MS/MS方法，同时测定龙胆药材中的7个活性成分，可为龙胆药材的质量控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器 3200 QTRAP质谱仪(美国AB Sciex)，Prominence UFLC型超高快速液相色谱仪(日本岛津)，FW80型粉碎机(天津泰斯特)，N-1300-WB型旋转蒸发仪(日本EYELA)。

1.2 试药 药品对照品，其中马钱苷酸(批号：111865-202005)、獐牙菜苦苷(批号：110785-201404)、龙胆苦苷(批号：110770-201918)和异荭草苷(批号：111974-201401)购自中国食品药品检定研究院，6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷(批号：180420)、獐牙菜苷(批号：140401)、异牡荆素(批号：18053107)购自成都普菲德生物技术有限公司，纯度均大于98 %。乙腈和甲醇为色谱纯(美国Fisher)。龙胆药材购自吉林市吉林大药房，吉林医药学院李景华副教授鉴定为真品。

1.3 色谱与质谱条件

1.3.1 色谱条件 Shim-Pack XR-ODS色谱柱(75 mm×3.0 mm，2.2 (m)，以0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)为流动相；梯度洗脱(0～12 min，10%→30%B；12～18 min，30%→55%B)，流速为0.5 mL·min-1，柱温35 ℃，进样量5 μL。

1.3.2 质谱条件 采用的离子源为电喷雾离子源，即ESI源，正离子检测，源喷雾电压和辅助加热气温度分别为5500 V、550 ℃，多重反应监测(MRM)进行扫描，检测的离子反应分别为m/z377.2→m/z215.2(马钱苷酸)、m/z375.2→m/z195.2(獐牙菜苦苷)、m/z519.2→m/z195.2(6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷)、m/z357.2→m/z195.2(龙胆苦苷)、m/z359.2→m/z197.1(獐牙菜苷)、m/z449.1→m/z 299.2(异荭草苷)和m/z433.2→m/z 283.2(异牡荆素)。上述7个成分的碰撞能量(CE)分别为13 eV、11 eV、20 eV、10 eV、12 eV、33 eV和35 eV。

1.4 溶液的制备

1.4.1 对照品储备液 分别精密称取7个对照品适量并置于5 mL容量瓶中，用甲醇配制成浓度为1.0 mg·mL-1的各成分对照品储备液。

1.4.2 供试品溶液 取龙胆药材粉末0.1 g于具塞锥形瓶中，加入甲醇溶剂20 mL，超声提取30 min，滤过后取续滤液1 mL，离心后用0.22 μm微孔滤膜过滤，所得即为供试品溶液。

1.5 线性关系考察 吸取上述各对照品溶液，用甲醇配制成系列混合对照品溶液，其中马钱苷酸浓度分别为2.5、5、10、25、50和 100 μg·mL-1，獐牙菜苦苷浓度为1、2、4、10、20和 40 μg·mL-1，6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷浓度为1、2、4、10、20和 40 μg·mL-1，龙胆苦苷浓度为5、10、20、25、50和 100 μg·mL-1，獐牙菜苷浓度为0.1、0.2、0.4、1、2和 4 μg·mL-1，异荭草苷浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1和 2 μg·mL-1，异牡荆素浓度分别为0.01、0.02、0.04、0.1、0.2和 0.4 μg·mL-1。将上述样品于UFLC-MS/MS联用仪中分析，同时记录峰面积。回归方程的横坐标是对照品的浓度(μg·mL-1)，纵坐标是峰面积积分值。

1.6 精密度试验 吸取上述混合对照品溶液，并连续进样6 次。

1.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液于室温下放置不同时间，于不同时间点(0、2、4、8、12、24 h)分析。

1.8 重复性试验 取同一批龙胆样品6 份，按上述方法得到供试品溶液；并分析测定，计算待测成分的含量。

1.9 加样回收率试验 取已知含量的同一批次龙胆样品9份，每份0.05 g，分别加入相当于样品中各测定成分含量80 %，100 %，120 %的对照品溶液适量各3份，并制备供试品溶液，进样分析。

1.10 样品含量测定 称取6批龙胆样品并制备供试品溶液，分析测定，计算7个待测成分在龙胆中含量。

2 结果与分析

2.1 质谱与色谱图 7种成分的产物离子扫描质谱图见图1，混合对照品和龙胆样品的MRM色谱图见图2和图3。

图1 马钱苷酸(A)、獐牙菜苦苷(B)、6'-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷(C)、龙胆苦苷(D)、獐牙菜苷(E)、异荭草素(F)、异牡荆素(G)的正离子产物离子扫描质谱图Fig 1 Full scan product ion spectra of loganic acid(A) swertiamarin(B) 6'-O-β-D- glucosylgentiopicroside(C) gentiopicroside(D) swertioside(E) isoorientin(F) isovitexin(G) in positive ionization mode

1. 马钱苷酸；2. 獐牙菜苦苷；3. 6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷；4. 龙胆苦苷；5. 獐牙菜苷；6. 异荭草苷；7. 异牡荆素1. Loganic acid; 2. Swertiamarin; 3. 6′-O-β-D- glucosylgentiopicroside; 4. Gentiopicroside；5. Swertioside；6. Isoorientin；7. isovitexin图2 混合对照品的MRM色谱图Fig 2 MRM chromatograms of mixed reference substances

1. 马钱苷酸；2. 獐牙菜苦苷；3. 6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷；4. 龙胆苦苷；5. 獐牙菜苷；6. 异荭草苷；7. 异牡荆素1. Loganic acid; 2. Swertiamarin; 3. 6′-O-β-D- glucosylgentiopicroside; 4. Gentiopicroside；5. Swertioside；6. Isoorientin；7. isovitexin图3 龙胆样品的MRM色谱图Fig 3 MRM chromatograms of Gentianae Radix Et Rhizoma sample

2.2 线性关系考察 7个成分的线性方程分别为：

Y= 5.716×103X+ 1.677×104r= 0.9996

Y= 2.088×104X+ 1.520×104r= 0.9995

Y= 1.441×104X+ 1.637×104r= 0.9995

Y= 2.221×104X+ 1.283×105r= 0.9996

Y= 3.574×104X-3.155×103r= 0.9995

Y= 2.462×104X+ 1.121×102r= 0.9998

Y= 5.731×104X- 2.823×101r= 0.9995

以上结果说明，上述7个成分分别在2.5～100 μg·mL-1、1～40 μg·mL-1、1～40 μg·mL-1、5～200 μg·mL-1、0.1～4 μg·mL-1、0.05～2 μg·mL-1和0.01～0.4 μg·mL-1具有良好的线性关系。

2.3 精密度试验 7个成分峰面积RSD值分别为2.8%、1.6%、1.4%、1.7%、2.6%、1.9%和2.5%，即仪器精密度良好。

2.4 稳定性试验 7个成分峰面积RSD分别为2.0%、1.8%、2.4%、1.7%、1.7%、2.4%和2.6%，表明供试品在24 h 内稳定性良好。

2.5 重复性试验 7个成分含量的平均值和峰面积RSD分别为0.644%(1.6%)、0.184%(1.9%)、0.155%(2.3%)、3.24%(1.6%)、0.00610%(2.2%)、0.00101%(2.1%)和0.000576%(2.6%)，即方法重复性符合要求。

2.6 加样回收率试验 结果见表1。

表1 龙胆样品中7个成分的回收率Tab 1 Recoveries of seven analytes in Gentianae Radix Et Rhizoma

2.7 含量测定 6批样品测定结果见表2。

表2 龙胆样品中7个成分的含量(%)Tab 2 The contents of seven analytes in Gentianae Radix Et Rhizoma (%)

3 讨论与结论

3.1 色谱和质谱条件的优化 实验中考察了不同种类的流动相组成，最终确定采用0.1%甲酸-乙腈作为流动相。通过分析时间和流动相比例的调整，优化后的梯度洗脱程序为0～12 min，10%→30%B；12～18 min，30%→55%B，此条件可将7个待测物成功分离，获得较好的分离效果。7个待测物在ESI源正离子模式响应较高。各待测成分主要形成的准分子离子均为[M+H]+且信号稳定，具体质荷比如下：马钱苷酸为m/z377.2、獐牙菜苦苷为m/z375.2、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷为m/z519.2、龙胆苦苷为m/z357.2、獐牙菜苷为m/z359.2、异荭草苷为m/z449.1、异牡荆素为m/z433.2，各离子灵敏度较高且信号较稳定。通过考察不同的碰撞能量(CE)，最终确定上述各待测成分的CE值分别为13 eV、11 eV、20 eV、10 eV、12 eV、33 eV和35 eV。本研究建立的UFLC-MS/MS分析方法同时测定龙胆中7个活性成分，与已有方法比较[13-14]，分析成分多、分离效果好、分析时间短、灵敏度高。

3.2 龙胆指标成分的选择 实验前期，为了能够较全面完整地完成龙胆的质量标准研究，对龙胆的指标成分进行了选择。龙胆的主要化学成分包括环烯醚萜苷类、黄酮类、三萜类、木脂素类、生物碱等[15-16]。《中国兽药典》2015年版中仅以龙胆苦苷为考察指标，测定指标较为单一，且仅用一种成分控制龙胆药材的质量也有一定局限性。马钱苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷和獐牙菜苦苷为龙胆中的环烯醚萜苷类成分，异荭草苷和异牡荆素为龙胆中的黄酮类成分。文献报道，马钱苷酸具有抗炎活性[7]，獐牙菜苦苷、獐牙菜苷具有保肝、降脂。促进细胞增殖等作用[8-10]。异荭草苷能够抗病毒[11]，异牡荆素具有降糖、抗菌等多种药理活性，近年来，有研究表明其对心肌细胞的瞬时外向钾电流亦具有明显的抑制作用[12]。因此，选择上述7个成分作为龙胆质量控制的指标成分。

3.3 龙胆药材的含量测定 本研究建立了UFLC-MS/MS方法对龙胆中的7个活性成分进行了含量测定，7个活性成分的含量顺序由高到低依次为：龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、异牡荆素、獐牙菜苷、异荭草苷。总体来看，环烯醚萜苷类含量要高于黄酮类成分。

3.4 结论 本研究首次建立了一种UFLC-MS/MS方法可同时测定龙胆中的7个环烯醚萜苷类和黄酮类活性成分的含量。该方法成功地测定了龙胆中上述成分的含量。本研究建立的UFLC-MS/MS方法具有分析时间短、分离效果好、灵敏度高等优点，可为龙胆在兽药领域的质量控制标准的提高提供参考。