测定龙胆草提取液中龙胆苦苷含量方法的建立

黄 静 刘文佳 梁雪松 黄光伟

(柳州两面针股份有限公司，广西 柳州 545001)

引言

龙胆为龙胆科植物条叶龙胆(Gentiana manshurica Kitag.)、龙胆(Gentiana scabra Bge.)、三花龙胆(Gentiana triflora Pall)或坚龙胆(Gentiana rigescens Franch.)的干燥根和根茎。龙胆草在中药制剂中使用非常广泛，且用量较大。目前药典中规定，龙胆草的药用部位为干燥根[1,2]，而大量的茎、叶、花则弃之。研究发现其根及根茎含有裂环环烯醚萜苷、生物碱、黄酮、甾体、香豆素及内酯等化合物[3]。其中龙胆苦苷含量最高，被《中国药典》定为质量标准控制的目标成分[4]。龙胆苦苷为环烯醚萜类化合物，现代药理学研究表明其具有保肝、利胆、健胃、抗炎、抗菌等功效[5-8]。本研究采用高效液相色谱法测定龙胆提取液中龙胆苦苷的含量，为龙胆提取液中龙胆苦苷含量的检测提供可靠的手段，以期为开发该药材药用价值提供参考依据。

1 仪器与材料

Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪系统(G7129A 1260Vialsampler,g7111 1260 Quat Pump VL,g7114A 1260VWD)；梅特勒-托利多ML204型电子天平；天津奥特赛恩斯仪器有限公司AS3120型超声波清洗器；梅特勒-托利多FE20型实验室pH计；龙胆苦苷对照品，中国食品药品检定研究所(含量以97.6%计)；Fisher chemical色谱纯甲醇；超纯去离子水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm, 5μm)；流动相为乙腈(B)-水(A)，流动相梯度如表1所示；流速为1mL/min；柱温35℃；检测波长为270nm；进样量20μL。按此色谱条件下测定，龙胆提取液样品色谱图见图1。

表1 流动相梯度

图1 龙胆提取液色谱图

2.2 对照品溶液的制备

精密称取龙胆苦苷对照品0.01g，置50mL容量瓶中，加入适量甲醇，振荡溶解，再加甲醇至刻度，摇匀，备用。

2.3 供试品溶液的制备

准确称取龙胆提取液0.1g，置10mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm滤膜过滤，滤液为供试品溶液。

2.4 标准曲线的绘制

精密量取2.2龙胆苦苷对照品储备液2、4、6、8、10mL分别置于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，依前述色谱条件进行测定。以峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归，得回归方程：

Y=13.8381X+7.3008

r=0.99991

结果表明，龙胆苦苷浓度在40～200 μg/mL时与峰面积有良好的线性关系。

2.5 精密度试验

取龙胆提取液制备的供试品溶液，依前述色谱条件连续进样6次，测定龙胆苦苷含量，结果见表2。6次进样测得样品龙胆苦苷含量平均值为1.6727，RSD为0.48%，结果表明，该方法精密度良好。

表2 精密度试验结果

2.6 稳定性试验

取龙胆提取液制备的供试品溶液，依前述的色谱条件在0、0.5、1.5、2.0、4.0、6.0、8.0、24.0 h分别进样，测定龙胆苦苷含量，结果见表3。结果表明，在24小时内供试品溶液稳定性良好，平均值为1.6611，RSD为0.69%。

表3 稳定性试验结果

2.7 重现性试验

取同一瓶龙胆提取液平行称取样品6份，依照2.3分别制备供试品溶液，进样测定，结果见表4。计算得龙胆提取液中龙胆苦苷平均含量为1.6682，RSD为0.43%，表明分析方法重现性良好。

表4 重现性试验结果

2.8 回收率试验

精密称取已知含量的龙胆提取液6份行样，分别精密加入不同量的龙胆苦苷对照品，搅匀，依照2.3制成供试品溶液，按上述方法进行测定，计算加标回收率，结果见表5。其平均回收率为99.78%，表明本方法准确可靠。

表5 回收率试验结果

2.9 样品测定

取龙胆提取液6批，依照2.3分别制备供试品溶液，进样测定龙胆苦苷含量，每批检测三次，计算其平均值，结果见表6。

表6 牙膏中龙胆苦苷含量测定结果

3 讨论

经反复实验最终确定使用Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流动相为乙腈-水，检测波长为270 nm，柱温为35℃，流速为1mL/min，在此条件下龙胆苦苷色谱峰分离较为理想。采用本方法测定龙胆提取液中龙胆苦苷含量，样品处理方法简便，流动相组成简单，龙胆苦苷浓度在40～200 μg/mL与峰面积成良好的线性关系(r=0.99991)，平均加标回收率为99.78%，能准确测定龙胆提取物中龙胆苦苷的含量，为控制该药材质量提供了可靠的方法。